蔬菜根结线虫生防芽胞杆菌的筛选及作用机理研究

张洁 夏明聪 朱文倩 梁娟 孙润红 徐文 武超 杨丽荣

（河南省农业科学院植物保护研究所 河南省生物农药工程研究中心 河南省作物保护国际联合实验室，郑州 450002）

根结线虫（Meloidogynesp.）是一种世界性分布的植物寄生线虫［1］，能够侵染超过3 000多种植物，包括多种大田作物、陆地蔬菜、树木及园林花卉等［2］，每年给世界农业生产带来严重经济损失，生产上亟需安全有效的防控方法［3-5］。化学农药对人畜和生态环境造成的危害越来越严重，对化学农药的使用限制也越来越严格［6］。为推进农业发展方式转变，有效控制农药使用量，促进农业可持续发展，我国农业农村部提出了农药使用量零增长的目标。生防微生物对生态环境安全友好，具有增产防病的长期效果，符合农业可持续发展和绿色植保理念的需求，是保障现代化农业优质丰产的重要手段［7-9］，也是实现农药“减施增效”的有效途径。

芽胞杆菌（Bacillussp.）具有高效多功能、抗逆性强、亲和性好等特点，是一类重要的植物病害生防资源［10］。目前，芽胞杆菌对植物寄生线虫的生物防治已受到广泛研究［11］。Xiang等［12］等测定了662株植物根际促生细菌对南方根结线虫（M. incognita）二龄幼虫的致死活性，结果显示Bacillussp.对二龄线虫比其他属的细菌表现出更高的致死率。史凤玉等［13］发现解淀粉芽胞杆菌（B. amyloliquefaciens）和巨大芽胞杆菌（B. megaterium）的胞外分泌物具有强烈的杀线虫活性。Gao等［14］报道蜡质芽胞杆菌（B. cereus）S2发酵液中鞘氨醇的对秀丽杆线虫和南方根结线虫具有较强的致死活性。但是目前被开发成杀线虫商品制剂的芽胞杆菌菌株较少，只有坚强芽胞杆菌（B. firmus）等被开发成产品并运用到农业生产中［6，15］，大大限制了线虫生防菌的应用和推广。因此，亟需挖掘对蔬菜根结线虫具有生物活性的优良芽胞杆菌菌株，为高效生物杀线剂的开发提供依据。

自然衰退现象在植物线虫病害中普遍发生，有学者将病害症状逐渐减轻或消失的土壤称为抑制性土壤［16］。目前主要认为土壤中的微生物是引起植物寄生线虫病抑制性土壤的主要因子，也是引起线虫病害自然衰退的主要原因［17］。研究表明，在植物寄生线虫的衰退土壤中有很多线虫的天敌，但是用福尔马林等药剂处理后，天敌受到灭杀或抑制，线虫病害反而加重发生［18］。因此，利用植物寄生线虫的自然衰退现象从土壤中寻找线虫的天敌，为防控植物寄生线虫病害提供了一条新思路。本研究从根结线虫病的抑制性土壤中分离和筛选芽胞杆菌，并初步研究优良菌株的生防机理，以期为蔬菜根结线虫病的绿色防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤及根结线虫 在开封市祥符区鄢陵府根结线虫病逐渐减轻的蔬菜大棚中采集抑制性土壤用于分离芽胞杆菌，在严重发生根结线虫病的茄科蔬菜大棚中采集发病根结分离卵囊用于生物活性测定，病原线虫经鉴定为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。

1.1.2 供试培养基 营养琼脂培养基（NA）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.2；营养肉汤培养基（NB）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化钠10 g/L，pH 7.2。

1.1.3 供试番茄品种 中杂9号，购于中蔬种业科技有限公司。

1.1.4 供试试剂 总糖含量测定试剂盒（ZT-2-Y），考马斯亮蓝法蛋白含量测试盒（KMSP-1-W），过氧化氢酶试剂盒（CAT-1-Y），乙酰胆碱酯酶测试盒（ACHE-1-W），羧酸酯酶测试盒（CARE-1-W），购于苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株的分离和纯化 将采集到的8份根围土壤样品过筛后80℃水浴10 min，经梯度稀释后涂布于NA平板中，置于28℃培养箱中培养1-3 d后，挑取NA平板上形态不同的单菌落进一步划线纯化，将纯化后的细菌单菌落4℃保藏于NA斜面培养基。

1.2.2 生防细菌的初筛 将分离得到的菌株接种于NB培养基，28℃、160 r/min培养48 h 后，10 000 r/min离心5 min，用0.22 μm的微孔滤膜滤除菌体，得发酵滤液。将发病根结剪成小片段，用1%次氯酸钠消毒2 min，用玻璃棒拍打收集卵粒，经冲洗与离心制备2 000 粒/mL的卵粒悬浮液，将卵粒置于25℃的恒温箱中孵化3-7 d后收集2龄幼虫，经冲洗与离心制备2 000条/mL的线虫悬浮液。向200 μL菌株发酵滤液中加入 50 μL线虫悬浮液，以空白液体培养基为对照，置于25℃培养箱中，48 h后通过滴加4% NaOH溶液判断线虫的死活［19］，计算线虫死亡率和校正死亡率［20］，每处理6次重复。向200 μL菌株发酵滤液加入50 μL卵悬浮液，以空白液体培养基为对照，25℃恒温箱中培养7 d后调查各处理中孵化出的二龄幼虫的数量，计算孵化率和卵孵化抑制率［20］，每处理6次重复。

1.2.3 室内盆栽防效测定 利用室内盆栽试验测定初筛得到的4株芽胞杆菌对南方根结线虫的防治效果，具体方法如下：将不同细菌菌株接种于NB液体培养基，30℃，150 r/min培养至OD600nm值为0.8-1.0得细菌发酵液。盆栽试验设置6个处理：（1）NB-04 10 mL/株灌根；（2）NB-36 10 mL/株灌根处理；（3）NB-12 10 mL/株灌根；（4）NB-18 10 mL/株灌根；（5）0.5%阿维菌素颗粒剂2 g/株穴施；（6）空白对照。每盆移栽1株番茄苗，每处理12个重复，浇透水后放在25℃人工气候室内培养，番茄移栽一周后接种根结线虫，在距离番茄根2 cm的无菌土中对称打2个1 cm深的小孔，注入线虫悬液，每株接种1 000条。移栽40 d后，根据分级标准［21］进行病情调查，计算根结指数和防治效果［22］，同时调查番茄的株高及鲜重。

1.2.4 菌株鉴定 将筛选所得菌株划线接种于NA培养基，30℃培养16 h后，利用扫描电镜观察其菌体大小、形状及其排列方式，30℃培养48 h后进行革兰氏染色，观察其是否产生芽胞及芽胞位置。利用细菌总DNA提取试剂盒提取NB-04菌株的基因组DNA，采用16S通用引物比对分析，并利用Mega 8.0软件构建系统发育树。

1.2.5 NB-04菌株生防机理初步研究 在体视镜下从发病根结中挑取卵囊，用1%次氯酸钠表面消毒1 min后，用无菌水冲洗3次备用。将NB-04菌株接种于NB培养基，28℃，160 r/min培养48 h后，10 000 r/min离心5 min，用0.22 μm的微孔滤膜滤除菌体，得NB-04发酵滤液。取饱满且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL离心管中，每管加入500 μL NB-04发酵滤液，以加入无菌LB培养基为对照，密封置于25℃培养箱中，在24、48、72 和96 h后加入1 mL缓冲液（pH 6. 0），在冰浴中充分匀浆后，4℃，10 000 r/min下离心10 min，取上清液作为酶源，根据相关试剂盒说明书分别测定NB-04发酵滤液对根结线虫卵囊过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶活性的影响，每处理重复3次。同时测定NB-04发酵滤液处理对根结线虫卵囊总糖和总蛋白含量的影响，具体方法如下：各处理取饱满且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL离心管中，每管加入500 μL NB-04发酵滤液，以加入等量的无菌LB培养基为对照，密封置于25℃培养箱中培养24 h，按照说明书要求测定卵囊总糖和总蛋白的含量，重复3次。

2 结果

2.1 根围土壤芽胞杆菌的分离与筛选

从土壤样品中共分离到62株芽胞细菌，其中，发酵滤液对二龄幼虫校正死亡率高于35%的菌株共有16株，占分离总数的25.8%（表1）。NB-04菌株发酵液处理48 h后校正死亡率达84.9%，NB-36、NB-18、NB-21、NB-12等菌株发酵滤液对二龄线虫的校正死亡率也都超过70%，分别为75.1%、72.4%、72.1%和70.5%。同时测定这些菌株对卵孵化的影响，结果显示，NB-36菌株处理的卵孵化率最低，为12.0%，卵孵化抑制率达到81.1%，其次为NB-12菌株、NB-04菌株、NB-31菌株和NB-11菌株处理，卵孵化抑制率分别达到78.7%、78.6%、76.7%和76.2%。

表1 不同细菌发酵滤液对根结线虫二龄幼虫的死亡率和卵孵化率的影响Table 1 Effects of the bacterial fermentation filtrates on the mortality and egg hatch rates of M. incognita J2

2.2 室内盆栽防效测定

从表2可以看出，4株芽胞杆菌中，NB-04菌液灌根处理的根结指数最低，为31.1，防治效果最好，达到61.6%，接近阿维菌素的防治效果（69.2%），同时显著增加了番茄的株高和鲜重。此外，NB-36和NB-12菌液灌根处理的防治效果也都超过50%，分别为57.2%和50.1%。由此可见，NB-04具有较好的生防潜力。

表2 不同生防菌株对南方根结线虫的盆栽防治效果及番茄植株生长的影响Table 2 Pot control effects of biocontrol strains against M. incognita and their influences on tomato plant growth

2.3 菌株鉴定

菌株NB-04在NA培养基上菌落为乳白色不透明，表面粗糙，边缘不规则（图1-A），扫描电镜结果显示NB-04菌体呈短杆状，大小为2.21 μm×0.58 μm（图1-B）；革兰氏染色阳性，孢中生至近顶生，大小为1.64 μm×0.72 μm（图1-C）。16S 序列分析结果表明，菌株NB-04的16S序列与甲基营养型芽胞杆菌的16S序列的同源性达99%；基于16S基因，采用邻接法构建菌株NB-04及其相似菌株的系统发育树，结果表明（图2），NB-04菌株与甲基营养型芽胞杆菌亲缘关系最近。结合形态学特征，将NB-04菌株鉴定为甲基营养型芽胞杆菌（B.methylotrophicus）。

图1 NB-04的形态学特征 Fig. 1 Mophological characteristics of NB-04

图2 NB-04菌株基于16S rDNA基因序列的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of strain NB-04 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 NB-04菌株发酵滤液对根结线虫卵囊酶活性的影响

2.4.1 对根结线虫卵囊过氧化氢酶活性的影响 NB-04发酵滤液处理24 h后，根结线虫卵囊过氧化氢酶活性略高于LB培养基对照，随着处理时间延长过氧化氢酶活性逐渐降低，对照组根结线虫卵囊过氧化氢酶活性逐渐升高（图3）。与对照组相比，96 h后NB-04发酵滤液对卵囊过氧化氢酶活性降低46.4%，说明NB-04菌株发酵滤液能够有效降低根结线虫卵粒内过氧化氢酶活性。

图3 NB-04菌株发酵液对根结线虫卵囊过氧化氢酶活性的影响Fig. 3 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the catalase activities of M. incognita egg masses

2.4.2 对根结线虫卵囊羧酸酯酶活性的影响 NB-04发酵滤液处理后卵囊羧酸酯酶活性具有先升高后降低的趋势，48 h比24 h活性上升0.27 nmol/mg，表现为激活作用，随后逐渐降低，而且NB-04发酵滤液处理后卵囊羧酸酯酶活性始终低于对照处理（图4），96 h后NB-04发酵滤液处理羧酸酯酶活性比对照降低89.1%。对照中卵囊羧酸酯酶活性逐渐增高，这可能与卵自身发育、孵化引起的酶活性变化有关。

图4 NB-04菌株发酵液对根结线虫卵囊羧酸酯酶活性的 影响Fig. 4 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the carboxylesterase activities of M. incognita egg masses

2.4.3 对根结线虫卵囊乙酰胆碱酯酶活性的影响 对照中乙酰胆碱酯酶活性逐渐降低，而NB-04发酵滤液处理具有先增高后降低的趋势，但是始终低于同时期的对照（图5）。96 h后NB-04发酵滤液处理乙酰胆碱酯酶的活性比对照降低52.8%，说明NB-04菌株发酵滤液能够显著降低根结线虫卵囊乙酰胆碱酯酶活性。

图5 NB-04菌株发酵液对根结线虫卵囊乙酰胆碱酯酶活性的影响Fig. 5 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the acetylcholinesterase activities of of M. incognita egg masses

2.4.4 对根结线虫卵囊总糖和总蛋白含量的影响 NB-04发酵滤液处理24 h后，根结线虫卵囊总糖量为9.6 μg/μL，对照组根结线虫卵囊总糖量为13.2 μg/μL，比对照显著降低降低27.3%，说明NB-04菌株发酵滤液处理能够显著降低根结线虫卵囊的总糖量。NB-04发酵滤液处理24 h后，根结线虫卵囊总蛋白量为26.6 μg/μL，而对照总蛋白量为54.8 μg/μL，约为处理组总蛋白含量的2倍，二者差异显著，表明NB-04菌株发酵滤液处理能够显著降低根结线虫卵囊的总蛋白量（图6）。

图6 NB-04菌株发酵液对根结线虫卵囊总糖（A）和总蛋白（B）含量的影响Fig. 6 Effects of NB-04 fermention on the content of total sugar（A）and protein（B）of of M. incognita eggs

3 讨论

分离和筛选安全高效的生防菌株是蔬菜根结线虫病生物防治及生防制剂开发的基础［6］。为挖掘蔬菜根结线虫病的优良生防菌株，本研究从蔬菜根结线虫病的抑制性土壤中分离芽胞杆菌，通过室内离体测定和盆栽试验筛选生防菌，获得高效生防菌株NB-04，并进一步将其鉴定为甲基营养型芽胞杆菌（B. methylotrophicus），丰富了根结线虫的生防资源。

甲基营养型芽胞杆菌是一种与枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌亲缘性很高的细菌［23］，其中枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌目前已被广泛用于线虫病害的生物防治中［24］，但是目前甲基营养型芽胞杆菌防治根结线虫的报道较少。Zhou等［25］报道甲基营养型芽胞杆菌R2-2菌株对南方根结线虫具有较强的拮抗活性，其菌液蘸根和种子处理均能够降低番茄根结线虫病的发生，防治效果分别达61.0%和40.0%。本研究中甲基营养型芽胞杆菌NB-04菌液灌根处理对番茄根结线虫病的室内防治效果达61.6%，接近阿维菌素的防治效果，同时显著增加了番茄的株高和鲜重，表现出较好的生防潜力，下一步将验证该菌株对根结线虫病的田间防治效果，为该菌株的开发利用提供依据

此外，甲基营养型芽胞杆菌已被报道用于其他真菌病害的生物防治中，Ge等［26］从吉林长白山休眠火山土中分离到一株甲基营养型芽胞杆菌（B. methylotrophicus），能够抑制多种植物病原菌的生长及孢子萌发，在室内盆栽试验中对番茄灰霉病的防治效果达60%，并能显著促进番茄植株的生长。Radhakrishnan等［27］报道芝麻叶面喷施甲基营养型芽胞杆菌KE2菌株能够显著促进芝麻生长并增强其逆境代谢，从而改善芝麻植株的健康状况。甲基营养型芽胞杆菌NB-04菌株对蔬菜真菌性病害的生防潜力有待于进一步验证。

本研究发现甲基营养型芽胞杆菌NB-04发酵滤液能够显著降低南方根结线虫卵囊的过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的活性。过氧化氢酶是一种重要的抗氧化保护性酶，推测NB-04发酵滤液胁迫线虫的抗氧化保护酶长时间抑制在正常水平之下，从而导致线虫机体的损伤或死亡。此外，羧酸酯酶是许多杀虫剂的重要代谢酶，乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸脂类药剂的靶标酶［28］，因此NB-04菌株发酵液诱导的线虫解毒酶和靶标酶与杀虫剂可能是相同的。此外，本研究发现NB-04发酵滤液能够显著降低线虫卵囊的总糖和总蛋白含量。总糖和蛋白质是线虫维持生命和生长发育的重要营养物质，其中糖作为线虫化学感受器的重要组成部分影响着线虫的趋向性，蛋白质作为线虫体表角质层的主要成分有助于线虫抵御外界不良环境［29］，因此，NB-04菌株的发酵滤液还可能通过破坏线虫糖和蛋白质的代谢活动而杀死线虫。下一步可以考虑将NB-04菌株与植物农药、有机肥、生物熏蒸、阳光消毒等结合使用，以提高其对线虫的防治效果。

4 结论

从蔬菜根结线虫病的抑制性土壤中分离芽胞杆菌，并利用室内离体测定和盆栽试验筛选获得高效生防菌株NB-04，通过形态学和分子生物学特征将其鉴定为甲基营养型芽胞杆菌（B. methylotrophicus）。初步研究了NB-04菌株对根结线虫的生防机理，结果显示NB-04菌株发酵滤液能够显著降低根结线虫卵囊过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的活性以及卵囊总糖和总蛋白含量，为蔬菜根结线虫病的绿色防治提供依据。