利拉鲁肽对脂多糖诱导大鼠肺微血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路的影响

来 静，李 娜，李 超

(1.安康市中心医院,陕西 安康 725000;2.西安交通大学第一附属医院,陕西 西安 710061)

急性肺损伤是一种以通透性肺水肿为典型临床特征的综合性疾病，是指因各种直接或间接致伤原因导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞的损伤,患者常出现弥漫性肺间质及肺泡水肿，发生急性低氧性呼吸功能不全[1-3]。其典型病理生理特征包括肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调等，临床表现包括进行性低氧血症、呼吸窘迫等，影像学检查可显示为非均一性的渗出性病变，发展至严重阶段可成为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratry distress syndrome，ARDS)[4-6]。急性肺损伤的病因较为复杂，流行病学调查显示，2005年美国急性肺损伤的发病率达到了79/10万，严重感染患者急性肺损伤发生率约为25%～50%，多发性创伤发生率约为11%～25%，总体数据调研显示急性肺损伤的病死率在15%～72%之间[7-8]。已有的研究[9-11]显示，高糖状态是急性肺损伤的独立危险因素，高血糖不仅会导致血管内皮功能紊乱，同时还会诱导血管内皮细胞凋亡，而通过改善血管内皮细胞功能，对改善因急性肺损伤引起的微血管内皮细胞损伤具有积极意义。利拉鲁肽是胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物[12]，已有的研究[13]指出，利拉鲁肽能够通过作用于PI3K信号通路来改善缺氧乳鼠心肌细胞凋亡进程，从而发挥一定的心肌保护作用。近些年还有学者发现GLP-1受体在肺微血管等组织中也有表达[14-15]，这为急性肺损伤的治疗提供了理论基础。本研究通过设置细胞对照实验的方式，探究利拉鲁肽对大鼠肺微血管内皮细胞生物进程的影响,以期为急性肺损伤的治疗提供新方向。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 选择出生5～6 d的体重在10～15 g的SD大鼠(购于北京清析技术研究院)，高糖DMEM(Thermo Fisher Scientific)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(美国Sigma公司)，胎牛血清(Ausbian)，利拉鲁肽(诺和诺德公司)，PISK/Akt阻断剂LY294002(东苍生物)，酶标仪(Biotek)。

1.2 实验方法

1.2.1 微血管内皮细胞分离与培养：取大鼠左肺75%乙醇浸泡15 s，清洗后剪碎，Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶于37 ℃条件下各消化10 min，离心后重悬于培养液中，于37 ℃、5% CO2条件下继续培养4 h，去除悬浮未贴壁细胞后继续培养，待细胞80%融合生长后使用胰蛋白酶消化传代，而后使用LPS 50 ng/ml刺激细胞生长6 h。

1.2.2 实验分组：在观察最适合细胞生长浓度时，分别设置0、1、10 、100 、1000 nmol/L五个浓度梯度的利拉鲁肽干预组；在观察利拉鲁肽通过作用PI3K/Akt信号通路对细胞蛋白表达、增殖迁移能力影响时区分为正常细胞组(0 nmol/L)、利拉鲁肽组(100 nmol/L)和100 nmol/L利拉鲁肽+10 μmol/L LY294002组。上述分组下药物作用时间均为24 h。

1.2.3 MTT法绘制细胞生长曲线：将细胞区分为五组后进行正常培养，细胞贴壁后按照分组予以各组不同浓度利拉鲁肽干预，每组细胞均接受药物干预24 h，而后加入MTT溶液，酶标仪570 nm下检测光吸收值，计算每组吸光度平均值并绘制细胞生长曲线。

1.2.4 Western blot检测Akt表达：三组细胞按照分组使用药物干预结束后，提取总蛋白，选择10%的SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离，分别使用PVDF洗膜、TBST洗膜后以β-actin作为内参，使用Quantity One软件采集信号后计算蛋白表达情况。

1.2.5 Brdu检测细胞增殖情况：三组细胞使用药物处理完毕后，加入含有Brdu的培养液培养6 h，固定液固定20 min后封阻液封闭30 min，加入抗体液并培养30 min后加入荧光液，避光培养30 min，最后加入复染液，于荧光显微镜下计算各组的红色荧光细胞所占的百分数。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移情况：将1代细胞置于培养皿上，分别使用利拉鲁肽和LY294002进行处理后，待细胞生长至80%～90%开始实验，划痕结束后细胞继续培养24 h，最后显微镜下观察各组细胞向划痕其余区域迁移的距离(cm)。

2 结 果

2.1 不同浓度利拉鲁肽对细胞增殖能力影响 待细胞贴壁生长24 h后，将细胞进行分组后分别使用0、1、10 、100、1000 nmol/L五个浓度梯度的利拉鲁肽进行干预，每24 h检测一次A570值，MTT绘制细胞生长曲线并开展组间差异性比较，结果显示，在同一时间点上，A值会随着利拉鲁肽浓度的升高而显著升高，在100 nmol/L时细胞达到最高促生长浓度，优于其他组别(均P<0.05)，继续增加利拉鲁肽浓度至1000 nmol/L并没有增加细胞增殖能力，见图1。

图1 不同浓度利拉鲁肽对细胞增殖能力影响

2.2 利拉鲁肽对肺微血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路蛋白影响 将细胞区分为正常细胞组(0 nmol/L)、利拉鲁肽组(100 nmol/L)和利拉鲁肽+LY294002组(100 nmol/L利拉鲁肽+10 μmol/L LY294002),正常干预后使用Western blot法检测p-Akt、Akt的表达情况，结果显示同正常细胞组相比，利拉鲁肽组细胞内的Akt、p-Akt表达水平显著升高(均P<0.05)，为进一步验证PI3K/Akt信号通路在蛋白表达中的意义，使用通路阻断剂LY294002进行干预后发现，细胞中Akt、p-Akt表达水平显著降低(均P<0.05)，见表1。

表1 利拉鲁肽对肺微血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路蛋白影响

2.3 利拉鲁肽对细胞增殖能力影响 Brdu结果显示，相比于正常细胞组，利拉鲁肽组细胞出现明显的增殖现象(P<0.05)，而应用通路阻断剂处理后，利拉鲁肽+LY294002组细胞的增殖情况明显较利拉鲁肽组细胞出现降低(P<0.05)，见表2。

表2 利拉鲁肽对细胞增殖能力影响(%)

2.4 利拉鲁肽对细胞迁移能力影响 通过划痕实验发现，相比于正常细胞组，利拉鲁肽的加入可以显著促进肺微血管内皮细胞向划痕空白区域的迁移生长(P<0.05)，而加入通路阻断剂进行处理后，再次比较显示利拉鲁肽+LY294002组细胞相较利拉鲁肽组细胞迁移能力显著下降(P<0.05)，见表3。

表3 利拉鲁肽对细胞迁移能力影响(cm)

3 讨 论

微血管是指直径在200 μm以下的血管，微血管内皮细胞是血液和周围组织之间开展物质交换的主要屏障，同时微血管能够合成和分泌多种生物活性物质，从而发挥抗炎、再生血管等重要功能，因而微血管的血液灌注对于组织正常功能的发挥起到重要作用[16-17]。肺微血管内皮细胞是气血屏障的重要组成部分，已有的研究[18-19]指出在多种肺相关炎症、损伤等引起的病理进程如急性肺损伤、ARDS中微血管内皮细胞通透性增加是上述病理改变的中心环节。传统的研究认为急性肺损伤是由肺微血管内皮细胞受损所致，但对于肺微血管内皮细胞损伤机制等认识不足，对其病理生理进程尚不清楚[20]。近些年随着分子生物学的不断进步，关于急性肺损伤相关信号通路的研究不断深入，多种信号通路在上述病理进程中发挥的作用被逐渐揭示。

本研究通过开展体外细胞实验的方式，详细论证了利拉鲁肽对LPS诱导大鼠肺微血管内皮细胞生物进程的影响，并初步探究了PI3K/Akt信号通路在影响肺微血管内皮细胞生物进程中所发挥的作用。研究结果显示，利拉鲁肽可以通过作用于PI3K/Akt信号通路进而促进肺微血管内皮细胞的增殖和迁移进程，该结论通过应用PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002得到了进一步的印证，说明了利拉鲁肽对于肺微血管内皮细胞具有较明显的干预效果。已有的研究[21]指出，细胞的迁移和增殖都会对血管再生和修复进程产生明显影响，通过促进细胞迁移和增殖能够缩短血管再生进程，加快受损血管的修复。GLP-1最早在糖尿病中发现可以促进β细胞和胰腺小岛内皮细胞的增殖，近些年GLP-1在心血管相关疾病的防治中发挥了重要作用，研究[22-23]证实GLP-1类似物诸如Exendin-4能够通过激化PKA-PI3K/Akt-eNOS信号通路来促进细胞DNA的合成，这种促增值作用也呈现明显的浓度和时间依赖性，在10 nmol/L浓度下作用24～48 h时增值作用最为明显，这与文中100 nmol/L利拉鲁肽干预下肺微血管内皮细胞增殖最为明显类似。

还有学者认为在创伤性血管疾病修复进程中，内皮增殖、迁移是促进再血管化的关键指标，该学者通过体内和体外实验研究证实GLP-1可以通过受体依赖途径促进HUVECs细胞在划痕实验中的迁移，但该学者未对其分子机制开展进一步的论证研究[24]。本研究则通过设立不同组别的方式研究发现，同正常细胞组相比，利拉鲁肽的加入明显加快了肺微血管内皮细胞的迁移和增殖进程，为验证该机制与PI3K/Akt信号通路的关系，文中设立了利拉鲁肽+PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002组，结果显示加入信号通路阻断剂后，实验细胞的迁移和增殖能力都出现了显著的下降，这说明了PI3K/Akt信号通路是影响实验细胞增殖迁移的关键信号通路之一。吴振华等[25]通过设立心肌微血管内皮细胞体外实验的方式，验证了利拉鲁肽是通过激活细胞内PI3K/Akt和MAPK/EPK信号通路，从而促进原代大鼠心肌微血管内皮细胞的增殖和迁移进程，这印证了本研究结果的真实性。

综上所述，利拉鲁肽对LPS诱导大鼠肺微血管内皮细胞的生物进程会产生显著影响，分析其原因可能与利拉鲁肽能够作用于PI3K/Akt信号通路有关。