小檗碱抑制人卵巢癌细胞HO-8910体外增殖机制研究

孙 育，刘朝阳，刘英洁

(西北妇女儿童医院，陕西 西安 710061)

卵巢癌发病率仅次于子宫体癌和子宫颈癌，是女性生殖器官最难治疗的恶性肿瘤之一[1]，严重影响广大患者的生活质量和寿命。卵巢上皮癌是最常见的卵巢恶性肿瘤，其病死率在各类妇科肿瘤中排首位，对女性生命造成严重威胁[2-3]。由于直到癌症广泛扩散临床上才可能观察到症状，因此在该疾病的早期阶段诊断仅仅占所有患者的四分之一。目前，手术与细胞毒性化学疗法相结合可在超过一半以上的患者中产生良好的临床反应[2]。紫杉醇和铂类是该联合治疗方案中使用的两种药物。但大多数患者接受紫杉醇和铂类联合治疗后，最终仍会复发[4]。肿瘤常见的治疗方法如手术切除、药物治疗和放射治疗等均不能起到理想的治疗效果[5]，基于此，寻求简便易行且安全有效的治疗方法极为重要。文献[6]报道，中药单体比如龙葵碱等具有抑制肿瘤细胞体外增殖的作用。另据文献[7]报道从中药黄连、黄柏中提取的小檗碱具有降血脂、抗癌、抗氧化等作用。最新研究[8]表明，小檗碱可以通过抑制血管生成进而促进癌细胞凋亡，但其对人卵巢癌上皮细胞体外增殖以及β-catenin信号通路的影响尚不清楚。本研究旨在探讨小檗碱对人卵巢癌上皮细胞增殖的影响及其机制，藉此为防治卵巢癌寻找新的药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HO-8910细胞株(人卵巢癌上皮细胞)购自广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司。小檗碱购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%，小檗碱溶于DMSO。DMEM培养基(美国Gibco 公司)、青霉素/链霉素双抗(美国Gibco 公司)，CCK8试剂购于美国Apexbio公司，细胞周期检测试剂盒(中国碧云天生物公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天生物公司)，细胞周期试剂盒试剂盒购于美国BD公司，Cyclin D1、 p21、β-catenin 和GAPDH 抗体均购于中国博士德生物公司，免疫组化试剂盒购于美国Cell Signal Technology有限公司。流式细胞仪购于美国BD Pharmingen 公司，转膜仪(美国Bio-Rad 公司)，全自动酶标仪(美国Thermo 公司)，倒置显微镜(德国奥林巴斯公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：HO-8910细胞株由DMEM培养基培养在37 ℃，5% CO2培养箱中，DMEM 完全培养基包含1% 双抗，10%胎牛血清，培养基3 d更换1次，细胞长势达到70%～80% 时，对细胞进行消化、传代和接种。

1.2.2 CCK8法检测小檗碱对HO-8910细胞株活力的影响：将HO-8910细胞培养到对数期，消化并计数，按照3×103个/孔接种于96孔板中，向对应试验孔中分别加入含有不同浓度的小檗碱(0、12.5、25、50、100 μmol/L)DMEM完全培养基,每个浓度组设3 个复孔，培养24 h后弃去培养基，将10 μl CCK-8染液加入到100 μl细胞培养液中，37 ℃条件下继续孵育4 h，使用酶标仪在490 nm测量吸光度。

1.2.3 流式细胞法检测小檗碱对HO-8910细胞周期分布的影响：将HO-8910细胞株以每孔3×105个/ml的密度接种至6 孔培养板，次日，加入不含小檗碱或含有50 μmol/L 小檗碱的DMEM完全培养基，培养24 h后，消化转移至离心管中，1000 r/min 离心5min。收集细胞，用预冷PBS在4 ℃冰箱固定4 h，参照试剂盒说明书的步骤检测细胞周期。

1.2.4 Western blot 检测小檗碱对HO-8910细胞增殖相关蛋白表达的影响：将HO-8910细胞株消化传代，并以每孔3×105个/ml的密度接种至6 孔培养板，次日，加入不含小檗碱或含有50 μmol/L 小檗碱的DMEM完全培养基处理24 h，倒掉培养基，参考BCA试剂盒进行蛋白质提取和蛋白浓度测定。每孔上样30 μg，用半干转膜仪转膜，之后用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，分别加入一抗β-catenin(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、p21(1∶1 000)和GAPDH(1∶1000)稀释液，将膜放入4 ℃冰箱摇床上，孵育过夜，次日加入TBST洗3 次，分别加入二抗(1∶3000)稀释液，用ECL 发光液浸膜 5 min，用凝胶成像仪进行显色反应并拍照记录，用GAPDH作为内参，用Image Lab 3.0软件进行条带定量分析。

1.2.5 RT-PCR法：将HO-8910细胞株消化传代，并以每孔3×105个/ml的密度接种至6 孔培养板，次日，加入不含小檗碱或含有50 μmol/L 小檗碱的DMEM完全培养基，培养24 h后，收集培养24 h后的各组细胞，弃去培养基，采用Trizol法提取RNA。以cDNA为模板进行RT-PCR反应。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 的相对表达量，GAPDH作为内参，各引物序列见表1。

2 结 果

2.1 小檗碱对HO-8910细胞活力的影响 见图1。当小檗碱浓度为12.5、25 μmol/L 时，小檗碱对HO-8910细胞株活性没有显著作用，当小檗碱浓度为50、100 μmol/L 时，小檗碱显著抑制HO-8910细胞株活性，与对照组(0 μmol/L小檗碱组)相比，其组间差异有统计学意义(P<0.01)，本研究在后续实验中选用50 μmol/L小檗碱为小檗碱组。

注：与0 μmol/L小檗碱组比较，**P<0.01

2.2 小檗碱对HO-8910细胞株细胞周期的影响 见表2。小檗碱组G0/G1期细胞百分比与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，小檗碱组中S期细胞百分比与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 两组细胞周期分布比较(%)

2.3 小檗碱对HO-8910细胞株增殖相关蛋白 mRNA表达水平的影响 见图2 。与对照组相比，小檗碱组中，β-catenin和Cyclin D1 mRNA表达量显著减少(P<0.05、P<0.01)，p21 mRNA表达量显著增加(P<0.01)。

2.4 小檗碱对HO-8910细胞株增殖相关蛋白表达水平的影响 见图3。与对照组相比，小檗碱组中，β-catenin和Cyclin D1蛋白表达量显著减少(P<005、P<0.01)，p21蛋白表达量显著增加(P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

卵巢癌是临床妇科最常见和最棘手的恶性肿瘤之一，其难于早期发现且发病机制尚未完全清楚，因此，多年来卵巢癌病死率稳居妇科第一[9]。目前，手术、化疗以及放疗仍是临床上主要的诊治方法，但对患者具有较大的创伤和不良反应[10]，而中药活性单体具有来源广泛、廉价，治疗安全有效的特点，未来中药活性单体具有广阔的应用前景。

小檗碱是一种生物碱，研究[11-12]发现小檗碱促进癌细胞凋亡是通过抑制巨噬细胞的形成介导的。本研究通过CCK8实验和细胞周期实验发现小檗碱可显著抑制HO-8910细胞增殖，并抑制细胞从G0/G1期向S 及G2期细胞转变。RT-PCR和Western blot探明了小檗碱可显著抑制HO-8910细胞增殖的作用机制，即小檗碱抑制了HO-8910细胞株β-catenin、Cyclin D1和p21蛋白和mRNA的表达。文献[13]报道，小檗碱通过降低Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65表达及提高Bax表达，有效抑制宫颈癌增殖及侵袭转移并诱导其发生凋亡，小檗碱通过将细胞阻滞于G0/G1期，并能够阻断NF-κB信号通路，从而抑制子宫内膜癌的转移[14]。本研究中，小檗碱通过抑制细胞从G0/G1期向S 及G2期细胞转变进而抑制HO-8910细胞增殖这一结果与已报道的小檗碱可抑制卵巢癌细胞增殖及诱导细胞凋亡相符[15]。

Wnt/β-catenin一般通路较多参与肿瘤的形成和发展，决定着肿瘤细胞增殖和凋亡的去向[9]。β-catenin是Wnt/β-catenin 信号通路的关键调控蛋白，在肿瘤中表达上调[16]，在各类细胞中起着粘连并传递信号的作用[17]，β-catenin与人类癌症中的致癌活性有关。越来越多的证据表明，β-catenin参与了卵巢癌的发生、发展和转移[18-19]。Cyclin D1在调节细胞周期进程中起着至关重要的作用。Lin等[20]发现了一个完美的T细胞因子4(Tcf4)结合位点(CTTGATC)，位于Cyclin D1启动子区域中的核苷酸-80和-73之间，提示β-连环蛋白/Tcf4途径可能参与了对T细胞因子4的调控下Cyclin D1表达。文献[21]报道在乳腺癌细胞系中，β-catenin/Tcf4途径参与细胞 Cyclin D1启动子的激活。Cyclin D1和p21是细胞周期调控极为重要的调节因子，Cyclin D1主要参与细胞周期的基因突变和随后细胞周期G1/S期的转变[22]。p21 作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)家族成员之一，可通过与Cyclin/CDK 蛋白激酶复合体相结合而抑制酶的活性，p21对CDK的抑制会在细胞周期的G1和G2阶段触发细胞周期停滞[23]，p21基因既与肿瘤抑制作用密切相关，又能通过抑制周期素依赖激酶复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连[24]。本研究中，小檗碱抑制了HO-8910细胞株Cyclin D1并促进p21的表达，导致细胞周期停滞在G1期，进而抑制了HO-8910细胞进一步增殖。此外，本研究的不足之处在于没有检测小檗碱对HO-8910细胞凋亡蛋白指标的影响，尚需进一步研究。

综上所述，小檗碱可通过抑制细胞内周期蛋白表达抑制HO-8910细胞增殖。该结果为小檗碱的抗癌作用提供了坚实的实验依据。