MutT同系物1抑制剂对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

靳娟娟，姚 玉

(铜川市人民医院血液科,陕西 铜川 727100)

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)属于原发性的恶性浆细胞肿瘤，是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大恶性血液系统疾病[1]，起因是B淋巴细胞在体内异常繁殖,克隆浆细胞产生大量单克隆免疫球蛋白或其片段不断蓄积，导致机体多个脏器发生损伤[2]，严重危及患者生命安全。最新研究[3-5]表明，该病发病率呈逐年上升趋势，占全身恶性肿瘤发病率的10%～13%，在美国全身恶性肿瘤病例中，MM占1.5%，多数患者生存期少于10年，除此之外，该疾病呈现明显的年轻化特点。目前MM治疗药物多为糖皮质激素，有良好的抗炎及免疫抑制作用，可显著改善患者预后、延长生存期，但长期使用上述药物不仅加重患者的经济负担而且易产生耐药性[6-7]，因此探索新的靶点、新机制成为目前急需解决的问题。MutT同系物1(MutT homolog 1,MTH1)是近年来研究较多的一种焦磷酸酶[8]，存在于脱氧核糖核苷酸三磷酸池中，能纠正活性氧过量引起的氧化损伤，防止细胞衰老、死亡，导致细胞恶性增殖。大量研究[9-10]表明，MTH1在正常细胞中是非必需的，但在肿瘤细胞中是必需的，且在非小细胞癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤疾病组织中呈现高表达，因此，近年来MTH1恶性肿瘤的新靶点已成为肿瘤治疗的主要研究方向。研究[11]表明MM组织中MTH1高表达，MTH1会影响肿瘤的发生、发展。本文主要通过探究MTH1抑制剂对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的影响，为进一步阐明MTH1抑制剂治疗MM的作用机制提供一定的证据支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 试剂：多发性骨髓瘤细胞株U266购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，胎牛血清[125 ml,Absin(上海)生物科技有限公司]，MTH1抑制剂TH588试剂(5 mg,美国Cheme Gen 生物科技公司)，CD138磁珠购于德国美天旎Miltenyi生物科技公司，人外周淋巴细胞分离液(200 ml,P8900,北京索莱宝生物科技有限公司)，Trizol试剂(100 ml，北京百奥莱博科技有限公司)，荧光素酶底物(10 mg/50 mg，美国Goldbio公司)，上述试剂按照贮存条件进行分装保存。仪器：实时定量基因扩增荧光检测Q-PCR仪(Quant Studio 5，德国赛默飞公司)，高速离心机(TD-5M，山东博科科学仪器有限公司)，酶标仪(Multiskan FC，德国赛默飞公司)，流式细胞仪(Cyto Flex，贝克曼库尔特公司)，反转录试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自德国赛默飞公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养：将多发性骨髓瘤U266细胞从液氮罐中取出，置于37 ℃水浴箱中解冻。完全融化后，吸取冻存液于含15%胎牛血清的培养液中，于37 ℃、含氧量95%、湿度饱和的培养箱中培养，每2～3 d更换1次培养液，显微镜下观察细胞处于对数生长期时可开展实验。

1.2.2 MTH1抑制剂TH588对细胞增殖的影响：取MM U266细胞铺满整个48孔培养板(5×103个/孔)，进行转染，每孔100 μl培养液。按照0.0、1.5、3.0、6.0、9.0 μmol/L的TH588的浓度梯度，将所有培养板分成五组，每组3板，置于37 ℃、含氧量95%、湿度饱和的培养箱中培养72 h，分别于0、48、72 h后每孔避光加入10 μl的荧光素底物，采用Multiskan FC酶标仪测定各时间点每孔悬液的荧光强度。同时，另取MM U266细胞转染于24孔培养板上，加入上述浓度梯度的MTH1抑制剂TH588，于0、48、72 h后，用Trizol试剂提取RNA进行反转录，Q-PCR扩增仪检测MTH1表达水平的变化情况。

1.2.3 MTH1抑制剂TH588对细胞凋亡的影响：取1.2.1中多发性骨髓瘤U266细胞转染于24孔培养板上，加入上述浓度梯度的MTH1抑制剂TH588，于72 h后收集细胞，采用Ca2+依赖的磷脂结合蛋白(Annexin V)合并碘化丙啶(PI)染色法共同捕获凋亡细胞，采用流式细胞仪进行分析，当对该方法呈双阴性结果时，说明该细胞为活细胞，未发生凋亡。

2 结 果

2.1 MTH1抑制剂TH588对多发性骨髓瘤细胞株U266增殖的影响 见表1、2。通过提取RNA进行Q-PCR扩增，检测每孔悬液的荧光强度及不同浓度抑制剂作用下MTH1表达水平的变化情况，结果表明，同一浓度随时间延长荧光强度增强，不同浓度下随TH588浓度的升高，荧光强度有所降低，且均显著低于0.0 μmol/L浓度组(均P<0.05)；MTH1的表达水平随时间延长也表现出明显升高趋势，同一时间点经TH588处理组表达显著低于0.0 μmol/L浓度组，随着TH588的浓度升高，MTH1表达水平呈明显降低趋势，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

表1 不同浓度TH588作用于U266细胞荧光强度比较

2.2 MTH1抑制剂TH588对多发性骨髓瘤细胞株U266凋亡的影响 见表3。采用Annexin V/PI双染色法测定TH588对MM U266细胞凋亡特性的影响，结果表明，随TH588浓度的升高，Annexin V/PI染色双阴性细胞的比例显著降低，且浓度越高，降低越明显，与0.0 μmol/L组相比存在统计学差异(P<0.05)。

表2 不同浓度TH588作用于U266细胞后MTH1的表达量

表3 不同浓度TH588对U266细胞凋亡的影响(%)

3 讨 论

MM是一种浆细胞恶性增生血液系统疾病，临床表现为贫血、急慢性肾衰竭、凝血功能障碍、高钙血症、溶骨性骨质破坏等症状[11-12]，严重危及患者生命安全。糖皮质激素是目前报道最多的治疗MM的药物，通过刺激骨髓瘤细胞产生抗炎及免疫抑制作用[13-14]，与蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等靶向药物共同作用，改善患者生存质量，但该治疗方法存在耐药性缺陷，因此探索新的靶点、新机制是目前临床治疗MM的主要研究方向[15]。MTH1是焦磷酸酶NUDIX家族一员，能减少活性氧过量对鸟嘌呤造成的氧化损伤，即水解8-氧代-dGTP成单磷酸形式，阻止细胞氧化衰老，是肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤的新靶点[16]。因此，本文主要探索MTH1及其抑制剂TH588对MM细胞增殖、凋亡的影响，为开发新的治疗靶点提供证据支持。

Satomi等[17]报道显示，MTH1作为肿瘤细胞常见靶点，在多种癌症疾病组织中呈现高表达的特点，进一步说明MTH1表达水平与MM具有明显的相关性，也验证了本实验选取MTH1抑制剂TH588对细胞生物特性有一定的合理性。

通过检测荧光强度探究TH588对细胞生物特性的影响，本实验将不同浓度TH588直接作用于对数生长期的MM U266细胞，荧光测定结果显示，TH588浓度越高荧光强度越低，表明TH588能够明显的抑制U266细胞增殖。Petrocchi等[18]研究发现TH588抑制肺癌肿瘤细胞的增殖可能与抑制细胞有丝分裂G2期DNA的复制、细胞分裂期以及酶与纺锤丝蛋白质的合成有关。研究[7]发现MTH1自身不是正常细胞必需的蛋白，能防止细胞进入正常的氧化衰老、凋亡过程，导致细胞恶性增殖，而TH588能明显抑制U266细胞中MTH1的表达，对临床开发新靶点的蛋白酶抑制剂治疗MM有一定的指导意义。

最后Annexin V/PI双染色凋亡实验表明，TH588浓度越高，双阴性细胞比例越低，说明该细胞膜未破损，染色剂未进入细胞内部，且该U266细胞为活细胞，其比例越低表明TH588浓度越高，对U266细胞的破坏率越高，从而促使肿瘤细胞凋亡最终达到治疗疾病的目的；吴晓波等[19]、Stewart等[20]通过探究TH588对乳腺癌肿瘤细胞生物特性的影响也发现该抑制剂能诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。虽然目前对正常细胞的毒性作用尚不清楚，但作为U266细胞新靶点的抑制剂，TH588具有一定的临床开发价值。

综上所述，MTH1抑制剂TH588表现出显著的抑制U266细胞增殖并促进其凋亡的作用，且有明显的量效关系，此为临床开发治疗MM的新靶点药物提供了实验依据。