无特定病原体级雌性昆明小鼠宫颈癌发生与阴道菌群紊乱相关性研究

张云清，李继斌，韩慧慧

(1.延安大学附属医院病理科,陕西 延安 716000;2.神木市医院病理科,陕西 神木 719300;3.延安大学附属医院妇产科,陕西 延安 716000)

当前宫颈癌发病率和病死率均居女性生殖道恶性肿瘤的首位，在发展中国家的发病率高于发达国家，农村高于城市[1]。宫颈癌的发生机制还不明确，但是高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papilloma virus，HR-HPV)的持续感染是宫颈癌发生的重要病因[2]。HR-HPV感染可导致阴道菌群紊乱，阴道菌群紊乱也会增加宫颈癌发生的风险[3]，但是具体的作用机制还不明确。女性的阴道系统比较复杂，包括阴道正常解剖结构、周期性内分泌变化、阴道微生物菌群、阴道宫颈局部免疫等。正常情况下，阴道微生物菌群相互适应、相互制约、相互协调，处于动态的平衡中，以乳杆菌为绝对优势菌，也共同构成阴道的生物膜[4-5]。当阴道菌群发生紊乱时，可导致阴道pH值、乳杆菌数量发生变化，从而导致阴道微生态失调状态。并且已有研究[6-7]认为乳杆菌是正常女性阴道内重要的生理性益生菌，对许多病原菌具有拮抗作用，而且还能有效地抑制相关肿瘤的发生与发展。并且异常阴道微生物群落和生殖道感染也会增加HR-HPV感染发生的几率，正常阴道微生物生态系统在降低HR-HPV感染发生率发生也发挥重要作用[8-9]。本文通过动物模型分析，探讨了无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级雌性昆明小鼠宫颈癌的发生与阴道菌群紊乱的相关性，希望为宫颈癌的治疗与管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级雌性昆明小鼠(n=48)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，6～8周龄，体重(20±2)g，饲养于本院实验动物中心，许可证号SCXK2132922。宫颈癌细胞株U14购自中国医学科学院基础医学研究所，流式细胞仪购自美国BD公司，各种生化试剂购自国药集团，FITC anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4购自美国Sigma公司。

1.2 动物分组与建模 将U14细胞株2 ml注入小鼠腹腔，经二代小鼠腹水培养后得到腹水细胞悬液，经2次生理盐水洗涤后，调整细胞浓度为2×107个/ml。将小鼠随机平分为宫颈癌组与对照组，每组24只。在正常状态下适应性饲养1周后，宫颈癌组在右侧背皮下注射0.2 ml细胞悬液建立宫颈癌模型，种植后7 d局部可形成直径为0.7～1.0 cm的肿块，所有小鼠均接种成功。对照组注射等剂量的生理盐水，实验观察21 d。

1.3 观察指标 ①每天记录进食量并观察记录小鼠的肿瘤生长与行为情况，宫颈癌组小鼠平均第7天成瘤，成模率为100.0%。②在建模第7、14天取小鼠的阴道分泌物进行涂片与染色，然后进行阴道菌群密集度与乳杆菌半定量评分；阴道菌群密集度评分：1分，能辨别1～3 种细菌；2分，能辨别4～6 种细菌；3分，能辨别7～9 种细菌；4分，能辨别≥10 种细菌；乳杆菌半定量评分：1分，每视野细菌数平均1～9 个；2分，每视野细菌数平均10～99 个；3分，每视野细菌数平均≥100个。③提取阴道分泌物的细菌DNA，针对16S rRNA区域进行PCR扩增，判定阴道菌群分型情况。④在建模第14、21天两组分别处死12只小鼠，取小鼠的腹腔主动脉血液1 ml，分离单个核细胞后，采用流式细胞仪检测CD3+、CD4+T淋巴细胞含量分布情况。

2 结 果

2.1 两组一般情况及每日进食量对比 对照组小鼠无任何异常表现。宫颈癌组小鼠皮毛失去光泽，粪便逐渐变软，精神萎靡，活动减少。宫颈癌组建模第7、14天的每日进食量均低于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组小鼠不同时间点每日进食量对比(g)

2.2 两组阴道菌群密集度与乳杆菌半定量评分对比 对照组的阴道优势菌属为乳杆菌属，占7.2%；宫颈癌组阴道优势菌属为巴斯德菌属和螺杆菌属，分别占26.3%和18.8%。宫颈癌组建模第7、14天的阴道菌群密集度评分高于对照组(P<0.05)，乳杆菌半定量评分低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组建模不同时间点阴道菌群密集度与乳杆菌半定量评分对比(分)

2.3 两组腹主动脉血T淋巴细胞分布情况对比 宫颈癌组建模第14、21天的腹腔主动脉血CD3+、CD4+T淋巴细胞比例均低于对照组(均P<0.05)，见表3。

表3 两组建模不同时间点腹腔主动脉血T淋巴细胞分布情况对比(%)

2.4 相关性分析 在建模第14天，Spearman相关性分析显示宫颈癌与阴道菌群密集度评分、乳杆菌半定量评分均存在相关性(均P<0.05)，见表4。

表4 SPF级雌性昆明小鼠宫颈癌发生与阴道菌群紊乱相关性

3 讨 论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均高居全球女性肿瘤前列，也是严重威胁我国妇女身体健康的重大疾病之一[10]。HR-HPV感染是导致宫颈癌发生的重要原因，但不是唯一原因，在其发病过程中可能还存在其它致癌因素或者协同HR-HPV发挥作用的因素，致使宫颈上皮细胞对HR-HPV的易感性增加，HR-HPV感染得以持续存在，从而诱发宫颈癌的发生[11-12]。

健康妇女阴道内存在多种微生物，包括细菌、真菌、原虫、病毒等，一些微生物执行生理功能的状况以直接影响女性的健康状况[13]。这些寄居在阴道内的微生物伴随着阴道局部环境的变化而不断发生演替，在维持阴道微生态平衡上发挥了重要作用。部分定植微生物可抵御病原菌的过量增殖，而或抑制在正常菌群中过度增长的潜在病原菌可导致机体致病[14]。阴道菌群密集度评分与乳杆菌半定量评分是临床常用的阴道微生态评价体系，两者相结合可共同评估阴道微生态平衡状态[15]。本研究显示宫颈癌组建模第7、14天的阴道菌群密集度评分高于对照组，乳杆菌半定量评分低于对照组。对照组的阴道优势菌属为乳杆菌属，占比7.2%，宫颈癌组阴道优势菌属为巴斯德菌属和螺杆菌属，分别占比26.3%和18.8%。乳杆菌是人体的正常菌群，具有抗肿瘤、抗衰老、抗感染、抗突变等多种活性，其可对机体的免疫功能进行调节，乳杆菌介导的对机体免疫系统的激活可能是机体保持抗肿瘤活性的重要途径之一。乳杆菌能够通过黏附素，与阴道上皮细胞表面特异性的黏附素受体结合，同时分泌大量细胞外多聚糖，从而拮抗其他致病菌的黏附和侵袭[16-17]。且乳杆菌可以利用阴道黏膜上皮细胞内的糖原产生乳酸等有机酸，使阴道保持酸性环境，有利于防止病原菌的入侵。而巴斯德菌属和螺杆菌属增加，可使阴道黏膜局部的免疫防御功能降低，可促进癌细胞的生长及宫颈癌病情的发展[18-19]。

肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关，细胞免疫介导的抗肿瘤效应是机体抗肿瘤的重要机制之一[20]。本研究显示宫颈癌组建模第14、21天的腹腔主动脉血液CD3+、CD4+T淋巴细胞比例都低于对照组。从机制上分析，对照组小鼠阴道菌群处于平衡状态时，CD3+、CD4+T淋巴细胞比例比较高，可维持机体正常的免疫功能，保障机体对肿瘤抗原的及时识别和清除。宫颈癌模型组小鼠伴随着CD3+、CD4+T淋巴细胞比例降低，使T细胞对肿瘤细胞的攻击、杀伤作用效果降低，导致机体出现肿瘤易感性[21]。

本研究显示Spearman相关性分析显示宫颈癌与阴道菌群密集度评分、乳杆菌半定量评分都存在相关性。从机制上分析，阴道菌群的紊乱促进了癌细胞的生长及宫颈癌病情的发展；宫颈癌也引起阴道菌群的紊乱[22-23]。并且阴道菌群的紊乱破坏了宫颈局部免疫功能，增加了病原体感染的风险；而病原体感染时又进一步加剧阴道局部免疫微环境生物屏障的破坏，导致阴道微生态系统失衡加重，最终导致宫颈癌[24]。本研究也存在一定的不足，没有设置宫颈良性病变组，没有对其他菌群进行分型分析，将在后续研究中进行探讨。

总之，SPF级雌性昆明小鼠宫颈癌伴随有阴道菌群紊乱，可影响小鼠的免疫功能，阴道菌群的紊乱介导的免疫逃逸作用可能促进了宫颈癌的发生发展。