青海省大通县犊牛粪样中隐孢子虫的鉴定及分子特征

李国平

(大通县畜牧兽医站,青海 大通,810100)

青海省大通县是青海省西宁市下辖县，地处青海东部河湟谷地，祁连山南麓，湟水河上游，是西宁地区水源之一，也是青藏高原和黄土高原的过渡地带。大通县属高原大陆性气候， 海拔 2 280～4 622 m，地势西北高东南低。养殖畜禽种类为牛、羊、猪、禽等，近年来该县畜牧业生产能力不断增强，成为社会经济发展新的增长点。

隐孢子虫是重要的人兽共患肠道原虫病，传播范围广公共危害大，在环境中一般以卵囊/包囊形式存在，人和家畜感染后有 80%表现出持续腹泻的临床症状，其程度与机体的免疫状态有关，免疫功能异常或免疫功能缺陷者往往表现为严重腹泻，迁延难愈，常可造成动物死亡。由于缺乏相应的检测手段和流行病学调查，长期以来兽医对于隐孢子虫一般都会当作细菌病进行治疗，结果造成抗生素的滥用和大量耐药菌株的产生。因此，开展动物源性隐孢子虫病的调查、病原基因型的鉴定和分子特征研究，对于这种原虫病的预防、公共卫生风险的评估以及追踪感染源都具有重要的意义。

为了掌握青海省大通县部分地区奶牛犊隐孢子虫病的流行情况，采集 大通县域地区200份奶牛犊粪样用于隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测。所有样品经蔗糖密度梯度离心法处理后用免疫荧光试验(IFT)和巢式 PCR(nPCR)方法进行检测，研究结果将为这种疾病的预防和控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪样采集 2017 年 8～10 月，以青海省大通县宝库乡和良教乡奶牛养殖户为调查对象， 采集奶牛犊(3-5 月龄)新鲜粪样共计 200 份，其中宝库乡 178 份，良教乡 22 份，分别编号为 QHDT2017001～QHDT2017200，每个采样管按等比例分别加入 25 g/L 的重铬酸钾溶液， 送实验室 4℃冰箱待检。粪样中的隐孢子虫的卵囊/包囊采用文献中推荐的蔗糖密度梯度离心法进行纯化。

1.1.2 主要试剂与仪器 QIAGEN 粪样 DNA 提取试剂盒、HotstarDNA 聚合酶等购自凯杰公司； PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、琼脂糖、电泳缓冲液和 DNA 标准 DL2000 等试剂购自上海生工生物工程有限公司；隐孢子虫荧光标记单克隆抗体检测试剂盒购自Cellabs 公司；酵母提取物和胰蛋白胨为英国 OXOID 公司产品，其它化学试剂药品均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光试验(IFT) 将 200 份样品纯化后，每份取 25 μL 涂于载玻片上，用于隐孢子虫卵囊和包囊的检测。样品涂匀后用甲醇固定，然后在样品上滴加荧光素标记的抗隐孢子虫单克隆抗体，样品置于湿盒中并在 37℃温箱孵育 30 min，之后用磷酸盐缓冲液(pH=7.4)冲洗 2 次，样品上滴加 15μL甘油，用盖玻片覆盖后使用免疫荧光显微镜观察卵囊/包囊的存在情况，通过隐孢子虫大小、形状、荧光等特征判定阴阳性结果。

1.2.2 样品DNA 的提取 所有样品经纯化后采用 QIAGEN 粪样DNA 提取试剂盒提取样品DNA， 提取的DNA 保存于-20℃冰箱备用。

1.2.3 隐孢子虫的PCR 扩增 参照文献引物和方法对所有样品采用 18S rRNA 基因扩增引物检测隐孢子虫的存在情况，扩增引物见表 1。PCR 产物纯化后送苏州金唯智生物技术有限公司采用 Sanger 法测序。测序结果与 GenBank 中的参考序列进行 BLSAT 比对分析，确定隐孢子虫种属；用 MegAlign 分析不同分离株和参考株之间序列的同源性，用 MEGA5.2 软件中的邻近法(NJ)构建系统发育树，计算各序列之间的遗传距离，确定隐孢子虫的基因型。

表1 本研究中用于隐孢子虫鉴定引物信息

2 结果

2.1 免疫荧光试验结果

样品与隐孢子虫荧光单抗反应后，用荧光显微镜观察涂片，共有 3 份样品发现具有隐孢子虫特征的卵囊(图 1)，大小约为 4.5μm×5.0μm，判定为隐孢子虫阳性。

图1 免疫荧光抗体法检测奶牛犊隐孢子虫卵囊(1000×)

2.2 PCR鉴定结果

将纯化的 200 份样品分别采用基于隐孢子虫 18S rRNA 基因引物的巢式 PCR 进行扩增，共有 2 份样品扩增出了大小约为 500 bp 左右的条带。PCR 产物测序后，经 BLAST 比对，结果均为隐孢子虫序列。

2.3 系统发育树分析

将隐孢子虫 PCR 产物测序结果与 GenBank 中下载的其它相关序列用进行多序列比对，用 MEGA5.0 软件构建遗传进化树，从遗传净化关系中可以看出本次检测出的犊牛隐孢子虫有 Cryptosporidium andersoni 和 Cryptosporidium bovis(图 2)。

表2 奶牛犊粪样间接免疫荧光和巢式 PCR 检测结果

图2 基于 18S rRNA 基因的隐孢子虫遗传进化分析

3 讨论

隐孢子虫是引起人和动物腹泻的重要原因病原体，主要通过水源感染动物和人类。青海省大通县位于湟水河上游，是西宁市水源地之一，因此检测该地区动物及河流中的隐孢子虫对于公共卫生学具有重要意义。在本次研究中通过巢式 PCR确定出隐孢子虫在奶牛犊中的感染率为 1%，这可能与采集的粪样大多数来自于健康犊牛以及犊牛的的年龄大于 2 月龄有关。之前 Wang GP 等采用 PCR方法研究青海省果洛地区犊牦牛腹泻原因时发现，隐孢子虫的感染率为 11.3%，该研究所有粪样均采自有腹泻症状和年龄小于 2 个月的犊牦牛。本研究采用 18SrRNA基因序列鉴定隐孢子虫虫种，结果表明大通县宝库乡和良教乡分离的虫株分别为 C.andersoni和 C. bovis，这与之前青海、河南和黑龙江报道的牛源隐孢子虫种基本一致。

本研究中采用 IFT显微镜检查和巢式 PCR检测了大通部分地区奶牛犊中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的流行情况，检测结果表明调查动物中贾第鞭毛虫的感染率高于隐孢子虫的感染率，这也对该地区奶牛腹泻病因的研究提供了重要的理论依据。由于在检测方法上，每种方法都有自己的优缺点，所以本研究中采用了两种方法平行检测。从检测结果可知，200份样品中只有 3份样品为隐孢子虫阳性，其中 2份为巢式 PCR检测阳性。不同检测方法产生的结果差异可能是由于样品中存在 PCR扩增抑制物，这种原因可能造成 PCR方法不能检出。此外， 样品 DNA浓度过低或模板 DNA分布不均匀以及 IFT的交叉反应现象也可能造成这种结果差异现象的发生。虽然 IFT方法在样品检测中比巢式 PCR敏感性强，但是 PCR方法特异性强，不会发生交叉反映，并且能够确定分离虫种的种属及其基因型，因此，该方法目前广泛应用各种病原体的鉴定及分子特征分析。另外，研究中还发现隐孢子虫为阳性的犊牛都有不同程度的腹泻症状，因此，有必要在该地区开展隐孢子虫病的预防措施，以避免人和其它动物的进一步感染。