不同种类样品检测禽白血病P27抗原结果分析

柳 林，王晓玲，赵梦姣，陈 静

(1.烟台市动物疫病预防与控制中心，山东 烟台 264003；2.山东省动物疫病预防与控制中心)

2019年5月，在山东省烟台市启动了白羽肉鸡主要疫病净化示范区建设项目，这是全国第一个家禽疫病区域净化项目，旨在深入落实《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》，推动《规模化养殖场主要动物疫病净化和无害化排放技术集成与示范》项目实施，对推动我国家禽主要疫病净化意义重大。禽白血病是白羽肉鸡主要净化疫病，是由禽白血病毒(ALV)引起的一类肿瘤性疾病。在鸡群中流行的主要有六个亚群，其中ALV-J 亚群致病性和传染性最强，主要传播方式为垂直传播和水平传播。目前该病尚无有效的治疗方法和疫苗预防，对种鸡群实施监控和净化是控制该病有效的方法之一，最常用的检测方法是检测p27 抗原，检测的样品为稀蛋清、泄殖腔拭子、胎粪等，其中应用最广泛是蛋清p27抗原检测。本文利用酶联免疫吸附试验的方法对泄殖腔棉拭子、蛋清 p27 抗原进行检测，分析其结果的差异性，进一步评估泄殖腔棉拭子p27 抗原检测结果应用的局限性。

1 材料与方法

1.1 样品来源

抽样原则为场点全覆盖、随机性、真实性，保证所采的样品具有代表性。在全市10个县市区抽取养殖场户31个，包括2个祖代场、29个父母代场，共采集种蛋900枚、咽喉/泄殖腔棉拭子900份。要求种蛋新鲜，咽喉/泄殖腔棉拭子置于同一个离心管中，种蛋和咽喉/泄殖腔棉拭子，应来自于同一栋舍。

1.2 样品处理

1.2.1 种蛋处理 种蛋放在蛋盘中冷藏2 d，恢复至室温，酒精棉球擦拭鸡蛋大头进行灭菌，再用镊子在鸡蛋的大头处打开一小孔，可见气室，从破壳处沿着蛋壳内壁挑破蛋膜，使用1 mL剪去尖头灭菌枪尖抽取蛋清约1 mL，放于1.5 mL EP管中，冷冻保存。

1.2.2 咽喉/泄殖腔棉拭子采集及处理 鸡只呈侧卧位保定，手持棉签伸入鸡喉头内或泄殖腔约1.5～2.0 cm，棉头紧帖腔内壁旋转 2～3 圈，取出后装入EP管中，折断棉签保留棉头，采集样品后尽快送到实验室进行检测。加入IDEXX 试剂盒中配备的样品稀释液1 mL，冷藏保存过夜，检测前2 000r/min 离心 5min，取上清液。

1.3 检测方法

检测蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原试剂盒购自美国IDEXX公司(批号：FR481)按照说明书进行检测。

2 结果

2.1 蛋清p27抗原检测结果

在10个县市区中，有5个县检测出p27抗原阳性，分别位于莱阳市、海阳市、莱州市、招远市、牟平区，阳性率分别为2.2%、1.7%、1.7%、3.3%、0.7%；全市采集共900枚种蛋，检出p27抗原阳性9份，总体阳性率为1.0%，详见表1和图1。

表1 蛋清禽白血病p27抗原检测结果

图1 蛋清禽白血病p27抗原检测结果

2.2 咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原检测结果

在10个县市区中，有6个县检测出p27抗原阳性，分别位于莱阳市、栖霞市、海阳市、蓬莱市、招远市、牟平区，阳性率分别为3.3%、1.7%、3.3%、1.3%、7.8%、1.3%；900份咽喉/泄殖腔棉拭子，检出p27抗原阳性19份，总体阳性率为2.1%，详见表2和图2。

表2 咽喉/泄殖腔棉拭子禽白血病p27抗原检测结果

图2 咽喉/泄殖腔棉拭子禽白血病p27抗原检测结果

2.3 检测结果比较使用美国IDEXX公司p27抗原试剂盒对蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子进行检测，检出蛋清阳性9份，阳性检出率为1%，检出咽喉/泄殖腔棉拭子阳性19份，阳性检出率为2.1%，检测结果相差较大，详见表3。

表3 不同种类样品禽白血病p27抗原检测结果比较

3 讨论

我国是全球第一大肉鸡生产国，白羽肉鸡是主要品种，烟台白羽肉鸡的市场占有率约为全国75%。在白羽肉鸡产业蓬勃发展的同时，也面临着巨大挑战，疫病流行对养殖业发展构成严重威胁。白羽肉鸡生长周期短，禽白血病传随着代次不断繁衍，流行和发病情况日趋严重。控制该病的主要措施是对禽白血病实施区域管控，进行大规模流行病学调查，淘汰阳性鸡只，净化鸡群。由于内源性ALV几乎无致病性，但会对外源性ALV的检测和鉴别造成干扰，目前，市场化应用最广泛的抗原试剂盒为美国IDEXX公司p27抗原试剂盒，还不能有效区分内源性和外源性的感染，所以选择有效的实验室检测方法和方式尤为重要。

本文对种鸡群900份咽喉/泄殖腔棉拭子进行ALV-p27抗原ELISA检测，阳性20份，阳性检出率为2.2%，对种鸡群900枚鸡蛋检测，蛋清ALV-p27抗原检测出阳性9份，阳性检出率为1%，蛋清检出率远低于咽喉/泄殖腔棉拭子。以县市区为例，在莱阳市、栖霞市、海阳市、蓬莱市、招远市、牟平区，蛋清p27抗原ELISA检测阳性率低于咽喉/泄殖腔棉拭子检测阳性率。而在莱州市，蛋清p27抗原检测出1份阳性，咽喉/泄殖腔棉拭未检出，可能是存在漏检；也可能是在采样环节，采集的鸡蛋和咽喉/泄殖腔棉拭虽来自同一鸡舍，但不是来自同一只鸡的缘故。在龙口市、开发区、福山区，均未检测ALV-p27抗原。综上，禽白血病实验室检测环节中，蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检出率都不相同，且两者之间的检测结果无明显的相关性。

2015年，沈学怀报道过，成年鸡以泄殖腔棉拭子作为 ELISA ALV-p27抗原检测材料存在假阳性结果。2017年，陈俊霞报道过，不同类型鸡的泄殖腔棉拭子 ALV-p27抗原检测法不仅有很高的假阳性率，还有一定比例的漏检率。2018年，黄秀英报道过，泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测不适合作为禽白血病净化的检测指标。本文通过ELISA试验检测蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原，证实两者不同的样品检出率都不相同，且之间的检测结果无明显的相关性，这与之前报道过的结果，具有一致性。在下一步制定种鸡场禽白血病净化路线时，应排除咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原的检测方案，不能以泄殖腔棉拭子作为检测材料。本试验证实了咽喉/泄殖腔棉拭子p27 抗原检测结果应用的局限性，为白羽肉鸡禽白血病净化检测方案的制定提供参考依据。