秃疮花唇肤康喷剂的抑菌杀菌试验

张莉敏，常攀峰，马志宏，孙春香，苟想珍，党 岩

(甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000)

秃疮花又称秃子花、红荗草、勒马回(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，是罂粟科中秃疮花属的2年或多年生长植物,分布在甘肃陇东等地。自20世纪80年代以来，我们国家的众多学者对秃疮花的化学成份、药物有效成份及秃疮花药物有效成份的药理作用都进行支持不歇的研究,从植物秃疮花中提取出秃疮花碱、别隐品碱、紫堇碱、原阿片碱、异紫堇碱、青风藤碱等多种化合物。研究表明，秃疮花药物有效成份对结核病和肝炎等疾病均有良好的治愈作用。金银花、大青叶、黄芩、苍术、连翘、黄柏、鱼腥草和甘草多是清热解毒类中草药，均有抗微生物和抗炎的作用，同时这些中草药之间有较好的协同作用。上述这些中草药不仅具有良好抗微生物作用，而且有调节动物机体免疫系统的机能从而促使动物机体的伤口愈合。中草药中的成分易于分解代谢，对人类绿色环保和公共卫生有重要的意义。

因此我们以甘肃陇东特色药用植物秃疮花(俗称红荗草，勒马回)为药材，研制具有抗菌消炎及抗病毒的兽医临床制剂，我们的项目进行了秃疮花制剂工艺、药效学、药物代谢动力学以及化学成分的研究工作和临床应用试验。本文仅就秃疮花唇肤康喷剂的抑菌杀菌试验进行论述，其它实验部分另文发表。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 电热培养箱等仪器来自于甘肃省畜牧兽医研究所的中心实验室。

1.1.2 菌株 试验中所用的全部菌株来自于甘肃省畜牧兽医研究所实验室。

1.1.3 药材 秃疮花采自于甘肃省平凉市，并由兰州物理化学研究所的天然药物实验室进行了鉴定；大青叶、连翘、黄柏、鱼腥草、黄芩、金银花、甘草和苍术采购于甘肃省医药公司，并由兰州物理化学研究所的天然药物实验室进行了鉴定。

1.1.4 实验试剂 牛肉膏 、葡萄糖、N aO H 、蛋白胨、琼脂 、酚红 、磷酸氢二钾 、N aCl购自于上海生工 ，其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 秃疮花外用制剂A液的制备方法 (1)用电子天平准确称取金银花3～4份、苍术2～3份、连翘3～4份、黄芩3～4份、黄柏3～4份、大青叶3～4份、鱼腥草2～3份和甘草2～3份，除苍术装入多个多层沙布袋内用100～200 mL 95%酒精在另一容器密封浸泡外，其它药物倒入瓷煲锅中,在煲锅中加入二蒸水1 600～2 000 mL、无水乙醇400～500 mL(分析纯)、苯甲醇(分析纯)5～15 mL和甘油(分析纯)5～15 mL，搅拌均匀后用盐酸(分析纯)调pH至5.0～6.0，密封浸泡。每隔30～60 min搅拌一次。如此将药物浸泡12～24h。(2)药物浸泡后，将苍术药包及药液合并至煲锅中搅拌均匀，加热煮沸1.5～2 h，当药液温度降至50～60 C°后，过滤煲锅中的药液0～4 C°保存备用并弃沉淀。然后苍术药包用100～200mL 95%酒精在另一容器密封浸泡，在煲锅中加入二蒸水1600～2 000 mL、无水乙醇400～500 mL(分析纯)、苯甲醇(分析纯)5～15 mL和甘油(分析纯)5～15 mL，搅拌均匀后用盐酸(分析纯)调pH至5.0～6.0，密封浸泡。每隔30～60 min搅拌一次，药物浸泡12～24 h后，将苍术药包及药液合并至煲锅中，煲锅加热煮沸1.5～2 h，当药液温度降至50～60 C°后，过滤煲锅中的药液0～4 C°保存备用并弃沉淀。如此重复3～4次。(3)弃药渣，合并上述4～5次所得药液，将药液加热蒸发进行浓缩至250～500 mL,当药液温度降至室温后，过滤高压灭菌后即得金银花复方中药外用消炎制剂，置0～4C°保存备用。

1.2.2 秃疮花外用制剂B液的制备方法 (1)用电子天平准确称取秃疮花干粉末500～1000 g，装入多个多层沙布袋内，扎紧袋口置于瓷煲锅中,加入二蒸水1 600～2 000 mL,无水乙醇400～500 mL(分析纯),搅拌均匀后用盐酸(分析纯)调pH至2.0～3.0，密封浸泡。每隔30～60 min将每个药袋充分挤压一次。如此将药袋浸泡12～24h。(2)将每个沙布药袋中的药液拧至煲锅中，过滤煲锅中的药液并弃沉淀；过滤后的药液和药袋一同置于清洗后的煲锅中，加热煮沸1.5～2 h，当药液温度降至20～25 C°后，将每个沙布药袋中的药液拧至煲锅中，过滤煲锅中的药液并弃沉淀；然后用1N的NaOH将药液的pH值慢慢调至10.0～11.0，过滤沉淀备用；加热煮沸1.5～2 h后，乘热过滤煲锅中的药液并弃沉淀，用1N的盐酸慢慢调pH至2.0～3.0过滤沉淀备用；药液倒出0～4 C°保存备用。(3)再将药袋置于煲锅中，加入二蒸水1 600～2 000 mL,无水乙醇400～500 mL(分析纯),搅拌均匀后用盐酸(分析纯)调pH值至2.0～3.0，每隔30～60分钟将每个药袋充分挤压一次。如此将药袋浸泡12～24 h; 加热煮沸1.5～2 h，当药液温度降至20～25 C°后，将每个沙布药袋中的药液拧至煲锅中，过滤煲锅中的药液并弃沉淀；然后用1N的NaOH将药液的pH值慢慢调至10.0～11.0，过滤沉淀备用；加热煮沸1.5～2 h后，乘热过滤煲锅中的药液并弃沉淀，用1N的盐酸慢慢调pH至2.0～3.0过滤沉淀备用；药液倒出0～4 C°保存备用。如此重复3～4次。(4)弃药袋，合并4～5次所得药液，加50～150 mL苯甲醇和50～150 mL甘油，用1N的NaOH(分析纯)将药液pH值调至5.0～6.0，将药液加热蒸发进行浓缩至500～1 000 mL,当药液温度降至室温后与药物沉淀混合成悬液，高压灭菌后即得秃疮花外用制剂，置0～4 C°保存备用。

1.2.3 秃疮花外用制剂的制备方法 (1)分别准确称量下述体积份的各制剂：秃疮花外用制剂B液1～3份，秃疮花外用制剂A液1～3份，乙醇1～2份；(2)将秃疮花外用制剂B液1～3份和秃疮花外用制剂A液1～3份,各自溶解于1～2份灭菌二蒸水中，混合加热至75～70 ℃搅拌；(3)等温度降至25 ℃时，加入1～2乙醇，搅拌混匀成秃疮花外用喷剂。

1.2.4 秃疮花喷剂的抑制微生物试验方法 组方组成：不同组方中所含的中草药成份请见下表。

表1 不同组方中所含的中草药成份

不同制剂的配制：组方1、组方2和组方3按秃疮花喷剂A液的制备过程进行配制；组方4按秃疮花喷剂B液的制备过程进行配制；组方5、组方6和组方7按秃疮花喷剂的制备过程进行配制。

实验方法：将实验用的不同微生物种株进行纯化后，接种于相应的THB营养肉汤或酵母营养肉汤中，37 ℃或24 ℃培养24 h后，分别用平皿计数法进行计数配制成1000 cfu/mL的微生物悬液；分别将各微生物悬液100 μL,分别加入6 mL各制剂与相应的营养肉汤按1∶1的比例制备的培养肉汤中,37 ℃或24 ℃培养16 h后用平皿计数法进行计数。最后按下列公式计算抑菌率:η=( C1～ C2)/C1×100%。,其中C1、C2分别是指对照管和试验管的的菌落数。

1.2.5秃疮花喷剂抑菌稳定性试验方法 (1)取制备好的秃疮花复方中药外用消炎喷剂A液和B液各500 mL，4 ℃条件下贮存1年。分别在刚完成制备时、4 ℃条件下贮存6个月和4 ℃条件下贮存1年时各取A液和B液150 mL蒸发浓缩10倍，按1∶1的体积比制成喷剂成，进行抑菌稳定性试验。(2)试验菌液的制备方法:首先试验用的各菌株进行一步分离且纯化，接种于相应的营养琼脂平皿上，在恒温培养箱中37 ℃的环境下培养24 h后4 ℃保存备用。正式试验前,在无菌环境下挑出典型标准的菌落，无菌接种于相应的普通营养肉汤中培养24 h。然后在无菌环境下挑出典型标准的菌落，用划线的方法接种于相对应的琼脂斜面上培养24 h后，再挑出典型标准的菌落，接种于相应的液体培养基中，经过37 ℃旋转恒温培养8 h后计数,并将其配成1×103 CFU /mL的菌液以供正式试验用。(3)秃疮花喷剂的抑菌稳定性试验方法:取含N量为31 mg/mL秃疮花喷剂，在相对应的培养肉汤中对倍稀释到1024倍,成为系列稀释的药物肉汤。然后取各组16～1024倍的系列浓度物做为试验组，试验对照组为末加药物的相对应的培养肉汤。试验组及试验对照组的试验管先105 ℃高压灭菌30 min后放置3～6 h使其温度降至室温后,在无菌条件下用移液管分别向各试验管加10%被试菌液,试验对照管用无菌生理盐水代替菌液。然后将其37 ℃培养培养14～18 h时间后,对各试验管和对照管分别按常规细菌计数进行计数,试验重复3次，计数结果按此公式计算抑菌率:η=( D1～ D2)/D1×100%。(其中D1、D2分别是指对照管和试验管的菌落数。)

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 秃疮花喷剂的抑制微生物试验结果

各组方对不同微生物的抑菌率见表2。

表2 各组方对不同微生物的抑菌率

秃疮花喷剂A液(组方1、组方2、组方3)和秃疮花喷剂B液(组方6)都有良好的抗微生物的作用，但作用的谱系不同，二者共用的秃疮花复方中药外用消炎喷剂(组方7)能使组方的抗微生物的作用增加及抗微生物作用谱系更广。

2.1.2 秃疮花喷剂抑菌稳定性试验结果

表3 秃疮花喷剂抑菌稳定性试验结果

从秃疮花喷剂抑菌稳定性试验结果可以看出，秃疮花喷剂，4 ℃条件下贮存1年，对大肠杆菌、链球菌和葡萄球菌均有较稳定的抑菌作用效果，对不同种类的细菌秃疮花喷剂杀菌抑菌浓度各有不同。

2.2 讨论

实验证明，尽管秃疮花喷剂A液和秃疮花喷剂B液都有良好的治疗动物皮肤炎症、溃疡和外伤的作用(见参考文献16)，但对于多种病因引起的同样症状的疾病治疗效果却不一致，导致这一结果的原因是对于多种病因引起的同样临床病状的疾病单一的消炎制剂抗微生物谱系不一且相对比较窄。利用秃疮花喷剂A液和秃疮花喷剂B液之间对动物皮肤炎症、溃疡和外伤的相互协同作用，能增加药物对动物皮肤炎症、溃疡和外伤的作用谱系范围；能增强药物对对动物皮肤炎症、溃疡和外伤的作用效能是研制秃疮花复方中药外用消炎喷剂的主要目的之一。同时，由于治疗动物外部皮肤炎症、溃疡和外伤的特殊性——如治疗工作人员的安全、动物口腔内部等部位的治疗困难、动物蹄部等部位药物难以固定、动物外部皮肤炎症溃疡及外伤治疗的群体性等等，因此根据动物不同部位和不同状况的外部皮肤炎症、溃疡和外伤疾病，使用喷剂进行治疗，能在确保治疗疗效的基础上，简化治疗过程，节省治疗时间，确保治疗操作人员安全是研制秃疮花喷剂的另一主要目的。