18F标记的苯乙烯基嘧啶类Aβ显像剂的制备与初步生物评价

李忠勇，沈浪涛，乔来成，王成志，梁 巍，沈 忱，崔海平

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中国原子能科学研究院，北京 102413)

阿兹海默病(AD)是影响人类，特别是老年人健康的重大疾病。许多研究证实，β淀粉样蛋白(Aβ)在AD发病中起着关键作用，因此，以Aβ为生物标志物，利用PET等分子影像学技术及相应的放射性药物，在临床症状发生之前进行Aβ显像，已成为早期无创诊断AD的重要技术手段[1-3]。近年来，大量小分子被设计用于Aβ显像，如18F-FDDNP、11C-PIB、18F-AZD4694、18F-GE67、18F-BAY94-9172、18F-AV45等，其中18F-AV45(即[18F]Florbetapir，商品名Amyvid，Eli lilly公司)、18F-GE67(即[18F]Flutemetamol，商品名Vizamyl，GE公司)和18F-BAY94-9172(即[18F]Florbetaben，商品名Neuraceq，Piramal公司)分别于2012年、2013年和2014年获得FDA上市许可，用于辅助诊断AD。这使得PET技术在早期无创诊断AD中表现出了极大潜力[3-5]。尽管如此，由于AD本身发病机理仍不明确，机理研究仍需深入，同时，新型Aβ显像剂的研发仍需继续，以期更好地解决AD的早期诊断[6-7]。在三种已获FDA上市许可的Aβ显像剂中，有两种(18F-BAY94-9172和18F-AV45)属于二苯乙烯类衍生物，对于该类Aβ显像剂，整个分子呈大共轭结构，其中一个芳环单元的对位通常含有给电子基团，如-NH2、-NHMe、-NMe2、-OH、-OMe等，对于保持与Aβ的高亲和性起重要作用，而另一个芳环单元有较大的可修饰性，如改变芳环结构(引入N、S等原子)、N甲基个数、聚乙二醇链长度等，苯乙烯基吡啶衍生物18F-AV45就是在18F-BAY94-9172的相应苯环结构中引入N原子，既保持了对Aβ的高亲和性，又能更快的达到高信噪比[8]。如果在18F-AV45的吡啶环结构中再引入氮原子，可以得到苯乙烯基嘧啶衍生物18F-SPm2和18F-SPm5，相关理论模型研究结果显示，18F-SPm2和18F-SPm5具有适宜的亲脂性(LogP=0.9～3.0)，可能具有作为Aβ显像剂的潜力[9]。本工作将18F-SPm2和18F-SPm5作为潜在的Aβ显像剂，进行相关研究，探讨其用作Aβ显像剂的可能性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；RE-5203A型旋转蒸发器：上海振捷试验设备有限公司；CRC-25R型活度计：美国CAPINTEC公司；6224型液质联用系统：美国AGILENT公司；400 MHz核磁共振波谱仪：德国BRUKER 公司；WIZARD2 2470型自动伽马计数仪：美国PERKINELMER公司；M-48型多头细胞收集器：美国BRANDEL公司；EVOS Fl型荧光显微镜：美国LIFE TECHNOLOGIES公司。

1.2 主要材料与试剂

C18液相色谱柱：美国AGILENT公司；Light C18柱、Light QMA柱：美国WATERS公司；18F离子溶液：原子高科股份有限公司；氨基聚醚K2.2.2：德国MERCK公司；色谱纯乙腈：美国SIGMA-ALDRICH公司；灭菌注射用水、氯化钠注射液：石家庄四药有限公司；其他试剂均为市售分析纯，国药集团化学试剂(北京)有限公司；除特别说明外，所用化学试剂均直接使用。

1.3 18F-SPm2和18F-SPm5的制备

1.3.118F-SPm2和18F-SPm5的结构

18F-SPm2和18F-SPm5的结构示于图1。

图1 18F-BAY94-9172、18F-AV45、18F-SPm2和18F-SPm5的分子结构Fig.1 Structures of 18F-BAY94-9172, 18F-AV45, 18F-SPm2 and 18F-SPm5

1.3.2标记前体化合物Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成[10-11]

标记前体化合物Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成路线示于图2。

图2 Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成路线Fig.2 Synthetic scheme of Boc-SPm2-OTs and Boc-SPm5-OTs

1) 化合物1的合成。10 mL水中加入1.2 g 4-氨基苯乙烯和2.91 g二碳酸二叔丁酯，35 ℃条件下搅拌4 h，用50 mL二氯甲烷萃取2次，混合有机相，依次用50 mL水、50 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA:VPE=1∶4作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

2) 化合物2的合成。在氮气保护下，30 mL无水N,N-二甲基甲酰胺中加入0.65 g氢化钠(70%)，0 ℃下滴加10 mL含2.19 g化合物1的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，0 ℃下搅拌1 h，30 ℃下搅拌1 h，0 ℃下滴加12.9 g碘甲烷，0 ℃下搅拌1 h，自然升温至室温，搅拌过夜，体系倾入40 mL 0 ℃饱和氯化铵溶液中淬灭，用120 mL乙酸乙酯萃取，有机相依次用40 mL水、40 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA∶VPE=1∶4作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

3) 化合物3的合成。50 mL无水四氢呋喃中加入2.09 g 2-氯-5-碘吡啶和6.76 g三乙二醇，分次加入1.11 g叔丁醇钾，70 ℃油浴加热回流10 h，减压除去溶剂，加入100 mL水，用100 mL乙酸乙酯萃取3次，混合有机相，用100 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA∶VPE=4∶1作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

4) 化合物4的合成。在氮气保护下，100 mL无水N,N-二甲基甲酰胺中加入1.66 g化合物2和2.49 g化合物3，并加入4.14 g四丁基溴化铵、4.9 g碳酸钾和103.92 mg乙酸钯，体系通氮排气20 min，然后100 ℃下搅拌20 h，减压除去溶剂，加入100 mL水，用100 mL乙酸乙酯萃取3次，混合有机相，依次用100 mL水、100 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA∶VPE=15∶1作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

5) 化合物5的合成。20 mL二氯甲烷中加入497 mg化合物4，0 ℃下加入467.32 mg甲苯-4-磺酰氯，并加入726 mg三乙胺和34.98 mg 4-二甲胺基吡啶，30 ℃下搅拌10 h，加入30 mL二氯甲烷和50 mL水萃取，水相用50 mL二氯甲烷萃取，混合有机相，依次用50 mL水、50 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA∶VPE=2∶1作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

6) 化合物6的合成。方法同化合物3。

7) 化合物7的合成。方法同化合物4。

8) 化合物8的合成。方法同化合物5。

1.3.3参比化合物19F-SPm2和19F-SPm5的合成[12-13]

参比化合物19F-SPm2和19F-SPm5的合成路线示于图3。

图3 19F-SPm2和19F-SPm5的合成路线Fig.3 Synthetic scheme of 19F-SPm2 and 19F-SPm5

1) 化合物9的合成。在氩气保护下，2.5 mL无水四氢呋喃中加入350.5 mg化合物5，0 ℃下滴加0.9 mL 1 mol/L的四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，60 ℃下搅拌5 h，减压除去溶剂，加入25 mL水，用25 mL二氯甲烷萃取2次，混合有机相，依次用25 mL水、25 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA∶VPE=2∶1作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

2) 化合物10的合成。4 mL乙酸乙酯中加入179.2 mg化合物9，0 ℃下滴加0.4 mL浓盐酸，30 ℃下搅拌5 h，减压除去溶剂，加入5 mL二氯甲烷，0 ℃下滴加2.5 mL三乙胺，30 ℃下搅拌0.5 h，减压除去溶剂，加入25 mL水，用25 mL二氯甲烷萃取2次，混合有机相，依次用25 mL水、25 mL卤水清洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物用柱层析色谱(200～300目硅胶，VEA∶VPE=2∶1作为淋洗剂)纯化，真空干燥。

3) 化合物11的合成。方法同化合物9。

4) 化合物12的合成。方法同化合物10。

1.3.418F-SPm2和18F-SPm5的放化合成

18F-SPm2和18F-SPm5的放化合成路线示于图4。

图4 18F-SPm2和18F-SPm5的放化合成路线Fig.4 Radiosynthetic scheme of 18F-SPm2 and 18F-SPm5

将由回旋加速器制备的[18F]F-水溶液通过活化的QMA柱，用1 mL K2.2.2/K2CO3溶液(体积比为96∶4的乙腈和水中含有K2.2.214.4 mg/mL和K2CO33 mg/mL)淋洗QMA柱，淋洗液接收入5 mL V底反应瓶中，密封，100 ℃加热及氩气流条件下蒸干溶液，加入1 mL无水乙腈，100 ℃加热及氩气流条件下蒸干溶液。V底反应瓶中加入1 mL 1 mg/mL Boc-SPm2-OTs或Boc-SPm5-OTs的无水DMSO溶液，120 ℃油浴加热10 min，加入0.25 mL 10% HCl溶液，120 ℃油浴加热8 min，加入0.825 mL 1 mol/L NaOH溶液，混合均匀后转移入10 mL小瓶中，再用4 mL H2O清洗V底反应瓶，洗液转移入同一小瓶中。

将得到的混合溶液通过活化的C18柱，用1 mL HPLC-CH3CN淋洗C18柱，淋洗液通过半制备HPLC(55% CH3CN和45% 20 mmol/L NH4OAc,流速:4 mL/min, 时间:20 min)进行纯化，收集需要组分并加入2倍的水，混合均匀，然后通过活化的C18柱，用0.5 mL乙醇淋洗，淋洗液加入4.5 mL NaCl注射液，混合均匀，最后通过0.22 μm无菌滤膜过滤。

1.4 18F-SPm2和18F-SPm5的脂水分配系数

在2支10 mL离心管中分别依次加入0.2 mL18F-SPm2或18F-SPm5的制剂溶液(约20 μCi)、2.0 mL PBS饱和的正辛醇和1.8 mL正辛醇饱和的PBS，涡旋5 min，5 000 r/min离心10 min，静置分层，分别取上层PBS饱和的正辛醇(OA相)和下层正辛醇饱和的PBS(PBS相)各0.2 mL于计数管中，平行取4次，测量放射性计数N，计算脂水分配系数LogP=Log(NOA相/NPBS相)值。

1.5 18F-SPm2和18F-SPm5的体外稳定性

取100 μL18F-SPm2或18F-SPm5的制剂溶液(约100 μCi)，加入1 mL生理盐水中，置于室温下，孵育5、30、60、120、180 min，采用Radio-HPLC法测定放化纯度，以观察稳定性。

1.6 体外荧光染色

AD患者脑切片(女性,64岁，颞叶)和转基因小鼠脑切片(C57BL6,APP/PS1,雌性,14月龄)各一张，经过3×20 min的二甲苯脱蜡，然后依次经过2×5 min的无水乙醇、2×5 min的95%乙醇、5 min的80%乙醇和5 min的70%乙醇洗涤，再经过流水冲洗10 min后，置于10 mmol/L的PBS中。将处理过的AD患者脑切片和转基因小鼠脑切片分别浸于5 μmol/L19F-SPm2或19F-SPm5的溶液(溶剂为20%乙醇溶液)中10 min，然后依次经过5 min的40%乙醇和2 min的去离子水洗涤，干燥后用荧光显微镜观察。

1.7 体外竞争结合

在12 mm×75 mm硼硅玻璃管中分别加入100 μL不同浓度19F-SPm2或19F-SPm5的乙醇溶液(10-3～10-9mol/L)、100 μL125I-IMPY溶液(计数率106min-1·mL-1)[14]、700 μL PBS和100 μL Aβ1-42水溶液(30 nmol/L)[15]，用封口膜密封，涡旋，在37 ℃恒温水浴中振荡孵育2 h，用0 ℃的PBS终止反应，多头细胞收集器收集反应液，用玻璃纤维滤膜分离结合复合物与游离的放射性配基，用3 mL 0 ℃的PBS冲洗三次，测量滤膜上的放射性计数。利用Graphpad Prism 4.0 分析数据得到半抑制常数IC50，根据Cheng-Prusoff方程计算抑制常数Ki。

1.8 体内生物分布

将100 μL18F-SPm2或18F-SPm5的制剂溶液(约100 μCi)经尾静脉注射到20只正常ICR小鼠(每组4只，20～25 g，雌性，北京华阜康生物科技股份有限公司)体内，分别于注射后5、30、60、120、180 min时，从眼部取血并迅速处死，解剖后取肺、心、肝、脾、胃、肠、肾、肌肉、腿骨、头骨、脑等器官，分别置于事先称重的计数管底部，测量放射性计数并称重，计算放射性摄取率(%ID/g)。

2 结果与讨论

2.1 18F-SPm2和18F-SPm5的制备

2.1.1标记前体化合物Boc-SPm2-OTs和Boc-SPm5-OTs的合成

化合物1的合成。得到白色固体，产率为100%。HRMS(EI):m/zC13H17NO2219.125 9(M),219。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.34(s,4H),6.66(dd,J=17.6,10.9Hz,1H),6.47(s,1H),5.65(d,J=17.6 Hz,1H),5.16(d,J=10.9 Hz,1H),1.52(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 152.63,137.93,136.19,132.49,126.83,118.40,112.36,80.58,28.33。

化合物2的合成。得到淡黄色液体，产率为89%。HRMS(EI):m/zC14H19NO2233.141 6(M),233。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ7.36(d,J=8.6 Hz,2H),7.17(d,J=8.5 Hz,2H),6.69(dd,J=17.6,10.9 Hz,1H),5.70(d,J=17.6 Hz,1H),5.23(d,J=10.9 Hz,1H),3.25(s,3H),1.45(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ154.66,143.32,136.13,134.60,126.30,125.35,113.55,80.35,37.20,28.33。

化合物3的合成。得到白色固体，产率为83%。HRMS(ESI+):m/zC10H15IN2O4(M+H)+355.014 9,355.022 3;m/zC10H15IN2O4(M+Na)+376.996 9,376.999 5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.64(s,2H),4.50(t,J=4.8 Hz,2H),3.88(t,J=4.8 Hz,2H),3.77-3.70(m,4H),3.70-3.65(m,2H),3.65-3.57(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.29,163.96,82.55,72.51,70.86,70.37,69.08,67.25,61.74。

化合物4的合成。得到白色固体，产率为48%。HRMS(ESI+):m/zC24H33N3O6(M+H)+460.244 2,460.248 8;m/zC24H33N3O6(M+Na)+482.226 2,482.231 0。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.45(d,J=8.6 Hz,2H),7.26(d,J=8.5 Hz,2H),7.05(d,J=16.4 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.56(t,J=4.8 Hz,2H),3.91(t,J=4.8 Hz,2H),3.78-3.72(m,4H),3.72-3.67(m,2H),3.66-3.59(m,2H),3.28(s,3H),2.60(s,1H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.15,156.68,154.55,143.72,133.31,129.28,126.65,125.47,125.21,20.62,80.57,72.57,70.89,70.39,9.27,66.99,61.76,37.13,28.34。

化合物5的合成。得到淡黄色胶状体，产率为81%。HRMS(ESI+):m/zC31H39N3O8S(M+H)+614.253 1,614.256 8;m/zC31H39N3O8S(M+Na)+636.235 0,636.237 9。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.80(d,J=8.3 Hz,2H),7.46(d,J=8.6 Hz,2H),7.34(d,J=8.1 Hz,2H),7.25 (s,1H),7.06 (d,J=16.5 Hz,1H),6.90(d,J=16.4 Hz,1H),4.53(t,J=4.8 Hz,2H),4.16(t,J=4.8 Hz,2H),3.85(t,J=4.8 Hz,2H),3.74-3.63(m,4H),3.62-3.57(m,2H),3.28(s,3H),2.44(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.26,156.69,154.56,144.76,143.71,133.33,133.00,129.81,129.22,127.98,126.64,125.47,125.17,120.69,80.57,70.78,70.75,69.35,69.25,68.71,66.98,37.13,28.34,21.64。

化合物6的合成。得到白色固体，产率为62%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.53(s,2H),4.51(t,J=4.8 Hz,2H),3.88(t,J=4.8 Hz,2H),3.77-3.70(m,4H),3.70-3.65(m,2H),3.65-3.57(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ163.62,159.59,111.96,72.57,70.84,70.34,69.09,67.38,61.73。

化合物7的合成。得到白色固体，产率为72%。HRMS(ESI+):m/zC24H33N3O6(M+H)+460.244 2,460.249 4;m/zC24H33N3O6(M+Na)+482.226 2, 482.231 7。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.45(d,J=8.6 Hz,2H),7.26(d,J=8.5 Hz,2H),7.05(d,J=16.5 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.57(t,J=4.8 Hz,2H),3.91(t,J=4.8 Hz,2H),3.78-3.72(m,4H),3.72-3.66(m,2H),3.66-3.59(m,2H),3.28(s,3H),2.72(s,1H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.12,156.67,154.54,143.72,133.29,129.30,126.66,125.46,125.21,20.60,80.57,72.55,70.90,70.40,69.27,67.02,1.76,37.13,28.34。

化合物8的合成。得到淡黄色胶状体，产率为85%。HRMS(ESI+):m/zC31H39N3O8S(M+H)+614.253 1,614.256 8;m/zC31H39N3O8S(M+Na)+636.235 0,636.237 8。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.80(d,J=8.4 Hz,2H),7.46(d,J=8.6 Hz,2H),7.34(d,J=8.0 Hz,2H),7.25(s,1H),7.06(d,J=16.5 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.53(t,J=4.8 Hz,2H),4.16(t,J=4.8 Hz,2H),3.85(t,J=4.8 Hz,2H),3.73-3.63(m,4H),3.63-3.53(m,2H),3.28(s,3H),2.44(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.22,156.68,154.56,144.76,143.72,133.32,133.00,129.81,129.24,127.98,126.65,125.47,125.18,120.66,80.57,70.78,70.75,69.34,69.25,68.71,67.00,37.13,28.34,21.64。

2.1.2参比化合物19F-SPm2和19F-SPm5的合成

化合物9的合成。得到白色固体，产率为81%。HRMS(ESI+):m/zC24H32FN3O5(M+H)+462.239 9,462.247 2;m/zC24H32FN3O5(M+Na)+484.221 8,484.229 1。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.45(d,J=8.2 Hz,2H),7.25(s,1H),7.05(d,J=16.4 Hz,1H),6.90(d,J=16.4 Hz,1H),4.62(t,J=4.0 Hz,1H),4.56(t,J=4.9 Hz,2H),4.50(t,J=4.0 Hz,1H),3.91(t,J=4.8 Hz,2H),3.79(t,J=4.0 Hz,1H),3.79-3.65(m,5H),3.28(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.29,156.68,154.55,143.71,133.34,129.18,126.64,125.47,125.14,120.71,83.99,82.31,80.56,70.85,70.54,70.34,69.37,67.03,37.13,28.34。

化合物10的合成。得到黄色固体，产率为88%。HRMS(ESI+):m/zC19H24FN3O3(M+H)+362.187 5,362.192 3;m/zC19H24FN3O3(M+Na)+384.169 4,384.171 2。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.57(s,2H),7.34(d,J=8.2 Hz,2H),6.97(d,J=16.4 Hz,1H),6.71(d,J=16.4 Hz,1H),6.59(d,J=8.2 Hz,2H),4.61(t,J=4.0 Hz,1H),4.54(t,J=4.9 Hz,2H),4.49(t,J=4.0 Hz,1H),3.99(s,1H),3.89(t,J=4.9 Hz,2H),3.78(t,J=4.1 Hz,1H),3.78-3.65(m,5H),2.86(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ163.80,156.14,149.42,130.14,127.83,25.95,125.64,116.30,112.38,83.99,82.31,70.83,70.52,70.32,69.40,66.87,30.54。

化合物11的合成。得到白色固体，产率为77%。HRMS(ESI+):m/zC24H32FN3O5(M+H)+462.239 9,462.246 7;m/zC24H32FN3O5(M+Na)+484.221 8,484.229 2。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.63(s,2H),7.46(d,J=8.3 Hz,2H),7.25(s,1H),7.05(d,J=16.4 Hz,1H),6.90(d,J=16.5 Hz,1H),4.62(t,J=4.0 Hz,1H),4.56(t,J=4.9 Hz,2H),4.50(t,J=4.0 Hz,1H),3.91(t,J=4.9 Hz,2H),3.79(t,J=4.2 Hz,1H),3.77-3.67(m,5H),3.28(s,3H),1.47(s,9H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ164.28,156.68,154.55,143.70,133.33,129.17, 126.63,125.46,125.13,120.71,83.99,82.31,80.56,70.85,70.53,70.34,9.36,67.03,37.13,28.34。

化合物12的合成。得到黄色固体，产率为81%。HRMS(ESI+):m/zC19H24FN3O3(M+H)+362.187 5,362.191 3;m/zC19H24FN3O3(M+Na)+384.169 4, 384.171 0。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.57(s,2H),7.34(d,J=8.7 Hz,2H),6.97(d,J=16.4 Hz,1H),6.71(d,J=16.4 Hz,1H),6.59(d,J=8.7 Hz,2H),4.62(t,J=4.1 Hz,1H),4.54(t,J=4.8 Hz,2H),4.50(t,J=4.1 Hz,1H),3.97(s,1H),3.90(t,J=4.9 Hz,2H),3.78(t,J=4.2 Hz,1H),3.78-3.67(m,5H),2.86(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ163.79,156.13,149.43,130.15,127.83,125.95,125.63,116.30,112.37,83.99,82.31,70.83,70.52,70.32,69.40,66.87,30.53。

2.1.318F-SPm2和18F-SPm5的放化合成

从[18F]F-起，至纯化结束，18F-SPm2和18F-SPm5放化合成总时间分别为170和190 min，衰减校正后的放化产率分别为20%和15%，放化纯度均大于99%，比活度均约10 GBq/mol。18F-SPm2和18F-SPm5保留时间均为8.4 min(如图5)，与相应的参比化合物19F-SPm2和19F-SPm5一致。

图5 18F-SPm2和18F-SPm5的HPLC谱图Fig.5 HPLC chromatograms of 18F-SPm2 and 18F-SPm5

2.2 18F-SPm2和18F-SPm5的脂水分配系数

18F-SPm2和18F-SPm5的脂水分配系数(LogP)分别为2.04和1.84，说明18F-Spm2和18F-Spm5具有适宜的亲脂性。

2.3 18F-SPm2和18F-SPm5的体外稳定性

18F-SPm2和18F-SPm5在生理盐水中室温放置3 h后的HPLC谱图见图6。由图6可知，18F-SPm2和18F-SPm5在生理盐水中室温放置3 h后，放化纯度仍大于99%，说明两者在生理盐水中的稳定性良好。

图6 18F-SPm2和18F-SPm5在生理盐水中室温放置3 h后的HPLC谱图Fig.6 HPLC chromatograms of 18F-SPm2 and 18F-SPm5 incubated in normal saline for 3 h at room temperature

2.4 体外荧光染色

每张切片染色后用靶向于Aβ的近红外染料DANIR-3b(1 μmol/L)染色定位[16]，体外荧光染色结果如图7所示。由图7可知，19F-SPm2和19F-SPm5均能标记出Aβ沉积的位置，但是与DANIR-3b相比，清晰度较差，说明虽然19F-SPm2和19F-SPm5与Aβ具有一定的亲和性和选择性，但18F-SPm2和18F-SPm5可能不是理想的Aβ显像剂。

图7 体外荧光染色结果Fig.7 Results of in vitro fluorescent staining

2.5 体外竞争结合

体外竞争结合实验采用125I-IMPY为放射性配基，Aβ1-42聚集体为受体蛋白，相关竞争结合曲线示于图8，结果表明19F-SPm2和19F-SPm5对125I-IMPY与Aβ1-42聚集体的结合均能产生抑制作用，经过定量计算得到两者的Ki值分别为246.6 nmol/L和318.2 nmol/L，表明19F-SPm2和19F-SPm5对Aβ1-42聚集体的亲和力较弱。

图8 相关竞争结合曲线Fig.8 Competitive binding curves

2.6 体内生物分布

18F-SPm2和18F-SPm5在正常小鼠体内生物分布如图9所示。18F-SPm2在注射后5 min时，肝、肾和肠放射性摄取率分别为32.73%ID/g、11.77%ID/g和15.85%ID/g，分别为血液放射性摄取率的5.83、2.10和2.83倍；18F-SPm5在注射后5 min时，肝、肾和肠放射性摄取率分别为24.42%ID/g、10.92%ID/g和9.83%ID/g，分别为血液放射性摄取率的5.90、2.64和2.37倍；说明18F-SPm2和18F-SPm5体内吸收迅速，除主要经肝代谢外，还经肾和肠等代谢。

图9 18F-SPm2和18F-SPm5在正常小鼠体内的生物分布Fig.9 Biodistribution of 18F-SPm2 and 18F-SPm5 in normal mice (n=4,

18F-SPm2在注射后5 min时，血和脑放射性摄取率分别为5.61%ID/g和4.29%ID/g，注射后60 min时分别为3.19%ID/g和2.58%ID/g，脑/血比分别为0.76和0.81，5 min和60 min脑放射性摄取比为1.66；18F-SPm5在注射后5 min时，血和脑放射性摄取值分别为4.14%ID/g和3.91%ID/g，注射后60 min时分别为2.83%ID/g和2.28%ID/g，脑/血比分别为0.94和0.81，5 min和60 min脑放射性摄取比为1.71；说明正常脑组织对18F-SPm2和18F-SPm5的放射性摄取能力较弱且清除较慢。另外，虽然18F-SPm2和18F-SPm5在骨中的初始放射性摄取水平较低，但随着时间的延长，腿骨和头骨中放射性摄取率均明显增加，说明18F-SPm2和18F-SPm5在体内存在明显脱氟现象，这会严重影响18F-SPm2和18F-SPm5作为Aβ显像剂的应用。

3 结论

本工作合成了两种18F标记的苯乙烯基嘧啶化合物18F-SPm2和18F-SPm5，两者放化纯度均大于99%，亲脂性和体外稳定性良好，体外实验表明19F-SPm2和19F-SPm5虽然能选择性结合Aβ，但对Aβ亲和力较弱，体内实验表明18F-SPm2和18F-SPm5的正常脑放射性摄取能力较弱且清除较慢，而且存在明显脱氟现象，这些结果都说明18F-SPm2和18F-SPm5不是理想的Aβ显像剂，也说明两种分子的设计存在缺陷。另外，苯乙烯基嘧啶结构中的二价键是否会受光作用影响、是否存在异构体等因素也可能对研究结果产生影响，应当纳入考虑。针对两者缺点的分子结构改造研究工作正在进行中。