99Tcm标记基于体内无铜点击化学的葡萄糖代谢显像剂

陈庆鑫，褚泰伟

(北京大学 化学与分子工程学院，放射化学与辐射化学重点学科实验室，北京 100871)

葡萄糖是糖在血液中的运输形式并能在体内氧化供能，在机体糖代谢中占据主要地位。恶性肿瘤细胞的异常增殖需要大量葡萄糖[1]，葡萄糖代谢旺盛的部位极有可能是潜在的肿瘤病灶。因此，葡萄糖代谢显像的临床意义重大。

氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)是目前研究最多的正电子葡萄糖代谢显像剂[2-4]，然而正电子发射计算机断层扫描(PET)及加速器售价昂贵。故此，研究和发展新型的非加速器核素制备的葡萄糖代谢显像剂仍是一项十分重要的工作。

由于放射性核素99Tcm具有良好的物理性能(t1/2=6 h，Eγ=140 keV)，而且价格低廉、来源广泛，所以99Tcm是单光子发射计算机断层显像技术(SPECT)诊断中常见的放射性核素。

然而，以往报道的99Tcm标记葡萄糖代谢显像剂都是先将葡萄糖和有机配体偶联，再与放射性核素99Tcm配位，形成一个体积庞大的分子探针。这种体积庞大的放射性核素及有机配体对葡萄糖基团有很大影响，偶联物体积庞大也是造成其生物评价效果不佳的主要原因[5-8]。 比如，Yang等[6]将一个N2S2配体与葡萄糖分子偶联(即ECDG)，该化合物可以与99Tcm形成稳定配合物；99Tcm-ECDG的动物体内分布实验发现，该化合物具有良好的瘤肉比，但血中放射性活度一直是肿瘤的两倍，不利于显像。分析可能的原因是该化合物可以被葡萄糖转运体识别，但无法被细胞内的己糖激酶磷酸化，所以很快被排出细胞外。

环辛炔与叠氮的[3+2]环加成点击反应[9]，具有在生物体系内反应速度快、无副反应发生等优点，有可能解决上述99Tcm标记的葡萄糖代谢显像剂存在的缺点[10-13]。

本工作旨在将点击化学应用到“预着靶-再快速、高效寻靶”的放射性葡萄糖代谢显像中，合成只含有小体积的叠氮基团的葡萄糖衍生物，首先完成葡萄糖基团在体内的预着靶，然后注射放射性核素标记的环辛炔探针进行再寻靶，通过高效体内点击反应实现葡萄糖代谢显像。

1 试剂与仪器

二苯并环辛炔、丁二酸单甲酰氯、三溴吡啶嗡、叔丁醇钾、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、乙二醇双2-氨基乙基醚、2-氨基乙硫醇、三苯甲醇、溴乙酰溴、溴乙酸乙酯、D-葡萄糖胺盐酸盐、4-溴丁酸乙酯：百灵威科技有限公司；盐酸羟胺、正辛醇：北京化工厂；苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐：吉尔生化(上海)有限公司；叠氮化钠：浙江东阳市凯明特种试剂有限公司；溴乙酸、3-溴丙酸、草酰氯：国药集团化学试剂有限公司；99Mo-99Tcm核素发生器：原子高科股份有限公司提供。

Bruker AVANCEⅢ(550 MHz)核磁共振仪、Bruker APEX Ⅳ FTMS 质谱仪：瑞士Bruker公司；Wizard Ⅱ 2470 series 自动伽马计数器：美国Perkin Elmer公司；Waters 1525 Binary HPLC Pump高效液相色谱仪：美国Waters公司。

2 实验动物

健康雄性昆明小鼠:清洁级普通动物，体重(20±2) g，由中国科学院动物所提供。向其左侧腋部皮下移植约106个S180细胞，小鼠肉瘤S180细胞株由北京大学生命科学学院提供。饲养在开放卫生环境里7～8 d后，肿瘤直径约10～15 mm时用于实验。实验前小鼠禁食16 h以上。

3 实验部分

3.1 标记前体的合成

ADIBO-MAMA和N3-DG-1～4的结构示意图示于图1。

图1 ADIBO-MAMA和N3-DG-1～4的结构示意图Fig.1 Structure of ADIBO-MAMA and N3-DG-1～4

(1) Gordon等[14]研究发现，具有双苯并的环辛炔化合物反应更为灵敏、反应速度更快。故参考文献[15-16]类似方法合成了含有二苯并环辛炔功能团的MAMA配体(ADIBO-MAMA)。

(2) 参照文献[17-21]合成了2位含有叠氮基且碳链长度不等的一系列葡萄糖衍生物(N3-DG-1～4)。

3.2 体外点击速率常数的测定

参照文献[22]报道的方法，测定四种2-叠氮葡萄糖化合物和ADIBO-MAMA在生理温度下的体外点击反应速率常数。分别配制化合物ADIBO-MAMA(10-3mol/L)、 N3-DG-1～4(2.0×10-2mol/L)的甲醇溶液。各取50 μL，加入400 μL甲醇后于37 ℃反应；取不同时间点的混合液由HPLC测定化合物ADIBO-MAMA的紫外吸收峰(254 nm)面积A。根据In(C0/C)=In(A0/A)=K1t，线性拟合求出一级动力学速率常数K1；再结合K1=K2×C0(N3-DG)，进而求出二级动力学速率常数K2。其中，C0为ADIBO-MAMA溶液初始浓度，C为ADIBO-MAMA溶液时刻t的浓度；A0为ADIBO-MAMA初始峰面积，A为ADIBO-MAMA时刻t的峰面积。

3.3 99Tcm-ADIBO-MAMA的制备及性质测定

99Tcm-ADIBO-MAMA参照相关文献[23]报道的方法制备。利用三氟乙酸(TFA)和三乙基硅烷对ADIBO-MAMA配体化合物中巯基基团上的三苯甲基进行脱除，然后脱保护后的配体(“N2S2”配体)与中间配合物—99Tcm标记的葡庚糖酸钠(99Tcm-GH)通过配体交换反应制得99Tcm-ADIBO-MAMA。

(1) 中间配合物99Tcm-GH的制备

取GH水溶液(0.1 mL，0.1 g/mL)，加入SnCl2·2H2O的盐酸(0.1 mol/L)水溶液(10 μL，2 g/L)，振荡混匀后利用氢氧化钠水溶液(0.1 mol/L)调节pH至中性(14.5 μL)；加入Na99TcmO4(活度约3.7×107Bq)，涡旋混合2 min，室温放置反应10 min，得到中间配合物99Tcm-GH，利用radio-HPLC测定其放化纯度。

(2)99Tcm-ADIBO-MAMA的制备

取1.0 mg ADIBO-MAMA溶于0.1 mL苯甲醚和0.4 mL无水甲醇， 冰水浴下加入100 μL TFA，反应2 min后加入50 μL三乙基硅烷，搅拌反应10 min；旋干，加入0.5 mL无水乙醇溶解稀释，充入少量氩气保护巯基；加入99Tcm-GH，振荡混匀，100 ℃下反应5 min，制得99Tcm-ADIBO-MAMA的乙醇溶液储备液；冷却至室温，利用radio-HPLC测定其放化纯度。动物实验中，将99Tcm-ADIBO-MAMA的乙醇溶液储备液，利用生理盐水稀释至20%乙醇溶液。

(3) 标记物的理化性质测定

标记物稳定性测定。常温下，标记物在空气中放置8 h；于不同时间取样利用radio-HPLC测定样品，分析标记物放化纯度的变化，评价其自身稳定性。

脂水分配系数的测定。取0.1 mL标记物储备液，加入到装有0.9 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)和1.0 mL正辛醇的离心管中，在室温下涡旋混合5 min，在2 000 r/min转速下离心5 min；从水相和有机相中分别取0.1 mL样品溶液，利用 Wizard Ⅱ 2470 series自动伽马计数器测定其放射性计数NW(水相中的计数)和NO(有机相中的计数)，根据脂水分配系数计算公式LogP(O/W)=Log(NO/NW)，计算得出标记物的脂水分配系数。平行三次，取平均值。

3.4 小鼠体内分布

取健康雄性昆明小鼠，以99Tcm-ADIBO-MAMA作为空白对照。预着靶策略：N3-DG-1或N3-DG-2(0.02 mol/L，0.1 mL)在小鼠肿瘤组织着靶2 h后，尾静脉注射99Tcm-ADIBO-MAMA(比活度约0.5 MBq/mL，0.1 mL)，通过体内点击反应进行寻靶。动物实验过程为：荷瘤小鼠尾静脉注射标记物后1、2、4、8 h，进行眼眶取血，断颈处死，解剖，取脑、肌肉、肿瘤、心、骨、胃、肠、肾、脾、肺和肝，清除内容物，清水洗涤，拭干，称重，自动伽马计数器分别测其放射性活度，计算每克组织器官占注射剂量的百分比(%ID/g)以及肿瘤与血液(T/B)、肿瘤与肌肉(T/M)的放射性摄取比值。每组五只小鼠，最终结果表示为(平均值±标准偏差)。使用SPSS 26.0(Statistical Product and Service Solutions 26.0)分析数据之间差异的显著性。

4 结果与讨论

4.1 化合物鉴定

实验中合成的化合物均通过1H NMR、13C NMR检测，结果显示均为目标产物。

ADIBO-MAMA1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 7.42-7.33(m,15H),7.26(s,4H),7.22(s,4H),7.21-7.14(m,8H),7.13-7.05(m,5H),3.80(s,2H),3.53-3.43(m,9H),3.36(dt,J=15.5,5.0 Hz,4H),3.07-2.93(m,6H),2.57-2.22(m,10H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 144.68,144.59,130.26,129.57,129.54,128.87,128.71,128.54,128.00,127.96,127.63,127.50,126.86,126.77,97.64,70.26,70.15,69.88,69.56,67.09,66.84,60.37,55.94,53.00,39.24,38.94,38.19,31.97,31.36,30.78。

N3-DG-11H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 5.56(d,J=8.6 Hz,1H),5.14-5.00(m,2H),4.30(dt,J=12.6,4.3 Hz,1H),4.14-4.05(m,1H),3.81(ddd,J=9.7,4.5,2.2 Hz,1H),3.70-3.60(m,1H),2.19(s,3H),2.09(d,J=3.7 Hz,3H),2.08(s,3H),2.03(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 170.50,169.75,169.60,168.53,92.61,72.80,72.76,67.88,62.64,61.45,20.86,20.67,20.62,20.54。

N3-DG-21H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 6.45(d,J=9.3 Hz,1H),5.80(d,J=8.7 Hz,1H),5.26(dd,J=10.4,9.4 Hz,1H),5.14(t,J=9.6 Hz,1H),4.32-4.25(m,1H),4.22(dd,J=10.3,9.2 Hz,1H),4.18-4.10(m,1H),3.91(s,2H),3.88-3.81(m,1H),2.12(s,3H),2.09(s,3H),2.05(d,J=1.0 Hz,6H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 170.90,170.59,169.28,169.25,167.02,92.25,72.96,72.20,67.78,61.65,53.28,52.63,20.84,20.68,20.56,20.55。

N3-DG-31H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 6.21(d,J=3.6 Hz,1H),5.75(d,J=8.9 Hz,1H),5.24(dt,J=23.9,9.6 Hz,2H),4.50(td,J=10.4,3.6 Hz,1H),4.30-4.22(m,1H),4.07(dd,J=12.4,2.2 Hz,1H),3.66-3.50(m,3H),2.38-2.31(m,2H),2.20(s,3H),2.09(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 171.79,170.64,169.90,169.06,168.55,90.51,77.27,77.01,76.76,70.59,69.80,67.48,61.55,51.26,47.13,35.70,20.85,20.79,20.65,20.53。

N3-DG-41H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 5.93(dd,J=33.1,10.3 Hz,1H),5.73(d,J=8.8 Hz,1H),5.23(dd,J=10.5,9.5 Hz,1H),5.13(t,J=9.7 Hz,1H),4.38-4.22(m,2H),4.14(dd,J=12.5,2.2 Hz,1H),3.86(ddd,J=9.9,4.7,2.3 Hz,1H),3.32(t,J=6.5 Hz,2H),2.30-2.16(m,2H),2.11(d,J=3.7 Hz,3H),2.09(s,3H),2.05(d,J=1.0 Hz,6H),1.94-1.77(m,2H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 171.89,171.23,170.69,169.46,169.35,92.52,72.86,72.57,67.98,61.76,52.98,50.51,33.06,24.55,20.87,20.73,20.67,20.58。

4.2 体外点击速率的测定

化合物ADIBO-MAMA与化合物N3-DG-1～4体外点击反应的各级动力学速率常数列于表1。

表1 ADIBO-MAMA与N3-DG-1～4体外点击 反应的各级动力学速率常数Table 1 Kinetic study of the click reaction between ADIBO-MAMA and N3-DG-1～4

由表1可知，叠氮基团与糖环相隔一定距离(N3-DG-2～4)与其直接连在糖环上(N3-DG-1)相比，点击速率大幅提升，可能的原因是糖环的位阻效应阻碍了三唑的形成。然而，一旦叠氮基团伸出糖环，随着其与糖环距离的进一步延长，反应速率并未有显著改变。

从表1结果可见，N3-DG-2更有希望成为合适的葡萄糖探针分子。最终挑选N3-DG-1作为对照组和N3-DG-2进行动物实验。

4.3 标记物的制备及性质测定

通过对标记体系中pH、SnCl2用量、反应温度、中间络合剂等条件进行优化后，所得99Tcm-ADIBO-MAMA的标记率大于95%，如图2所示。常温下，标记物在空气中放置8 h后放化纯度大于95%，具有较好的体外稳定性。99Tcm-ADIBO-MAMA标记物LogP(O/W)=0.98±0.01，显示为脂溶性。

4.4 体内分布实验

99Tcm-ADIBO-MAMA(空白对照)及其与N3-DG-1，N3-DG-2体内点击产物在荷S180肿瘤小鼠体内的生物分布结果列于表2～表4。

图的Radio-HPLC分析图Fig.2 Radio-HPLC (a), 99Tcm-GH (b), 99mTc-ADIBO-MAMA (c)

表2 99Tcm-ADIBO-MAMA在荷瘤小鼠体内的放射性摄取率(n=5)Table 2 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA in tumor-bearing mice (n=5)

续表2

表3 99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-1体内点击后在荷瘤小鼠体内的分布结果(n=5)Table 3 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA’s click reaction product with N3-DG-1 in tumor-bearing mice (n=5)

表4 99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-2体内点击后在荷瘤小鼠体内的分布结果(n=5)Table 4 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA’s click reaction product with N3-DG-2 in tumor-bearing mice (n=5)

从表2～表4可以看出，99Tcm-ADIBO-MAMA、99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-1，N3-DG-2体内点击产物的肝摄取较高；这与化合物呈脂溶性相关。心、肺、胃和肌肉在开始有少量摄取，但很快清除。脑中则几乎无摄取。

另外，从肿瘤/血液比值数据(表5)可以看出，在时间点为1 h，99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-1，N3-DG-2体内点击产物的瘤血比均比99Tcm-ADIBO-MAMA有较大提高，存在显著性差异；在时间点为2 h，99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-2体内点击产物的瘤血比与99Tcm-ADIBO-MAMA的类似，没有显著性差异；在4 h和8 h，99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-2体内点击产物的瘤血比大于99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-1体内点击产物，有显著性差异。相比于N3-DG-1(对照组)，99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-2体内点击更易发生，具有更好的肿瘤摄取和滞留。该结果与体外点击反应速率快慢(表1)一致。

表5 99Tcm-ADIBO-MAMA (a)及其与N3-DG-1 (b)， N3-DG-2 (c) 体内点击产物在荷S180肿瘤小鼠体内的瘤血比(n=5) Table 5 Comparison of tumor/blood ratios among 99Tcm-ADIBO-MAMA (a), its click reaction product with N3-DG-1 (b)，N3-DG-2 (c) in tumor-bearing mice (n=5)

从肿瘤/肌肉比值数据(表6)来看，在各个时间点，99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-2体内点击产物的瘤肉比均比99Tcm-ADIBO-MAMA有较大的提高，存在显著性差异；同样，相比于N3-DG-1(对照组)，99Tcm-ADIBO-MAMA与N3-DG-2体内点击产物的瘤肉比提高的幅度更为明显，存在显著性差异，在时间点8 h时，瘤肉比高达10.27±3.30。该结果与体外点击反应速率快慢(表1)也一致。因此，N3-DG-2比N3-DG-1的体内分布效果好，更具有作为葡萄糖代谢显像剂的潜力。

表6 99Tcm-ADIBO-MAMA (a)及其与N3-DG-1 (b)， N3-DG-2 (c) 体内点击产物在荷S180肿瘤小鼠体内的瘤肉比(n=5)Table 6 Comparison of tumor/muscle ratios among 99Tcm-ADIBO-MAMA (a), its click reaction product with N3-DG-1 (b)，N3-DG-2 (c) in tumor-bearing mice (n=5)

5 结论

合成了MAMA偶联的二苯并环辛炔配体和四种2-位含有叠氮基的小分子葡萄糖基团，体外反应速率测定实验选定了两种葡萄糖衍生物N3-DG-1(速率最慢，作为对照组)和N3-DG-2(速率最快)；接下来采用配体交换的方法完成了ADIBO-MAMA的99Tcm标记，标记条件优化后，标记率在95%以上。基于体内点击化学，首先完成N3-DG-1和N3-DG-2在体内的预着靶，再注射99Tcm-ADIBO-MAMA进行寻靶，发生体内点击反应，以99Tcm-ADIBO-MAMA为空白对照，根据动物分布结果筛选出最合适的葡萄糖代谢显像剂。从动物分布实验来看，N3-DG-1和N3-DG-2相比，后者的瘤血比和瘤肉比也要优于前者，但N3-DG-2预着靶策略对瘤肉比的改善较为明显，对瘤血比的改善效果不佳，所以，还有待寻找其他的小分子葡萄糖基团以及对二苯并环辛炔改性(提高其水溶性)来进一步提高瘤血比。