Aβ显像剂18F-AV45的自动化合成及临床验证

2021-08-19黄政海朱世坤王雪竹吴美其

同位素 2021年4期

黄政海，任超，朱世坤，王雪竹，吴美其，霍力

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413； 2.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院核医学科核医学分子靶向诊疗北京市重点实验室，北京 100730)

(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺((E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-fluoroethoxy)ethoxy)ethoxy)pyridine-3-yl)vinyl)-N-methyl benzenamine，18F-AV45)是一种由放射性核素氟-18标记的苯乙烯基吡啶衍生物，是美国食品与药品管理局于2012年批准的第一个用于阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)诊断的β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)显像剂。18F-AV45对Aβ斑块具有良好的亲和力，能够实现特异性结合，在临床AD患者诊断中发挥着重要作用[1-3]。

目前，虽然国内关于18F-AV45的临床研究报道较多，但对18F-AV45的合成研究报道较少，且涉及的化学合成模块以国产氟多功能合成模块为主[4-5]，尚未有文献报道使用TRACERlab FX2 N合成器开展18F-AV45制备工作，而目前TRACERlab FX2 N合成器市场占有率超过50%，临床应用广泛，为探索出适用于该合成器合成18F-AV45的合成方法，本文在参考相关文献基础上[6-7]，以AV105为前体，在进口氟多功能合成模块TRACERlab FX2 N合成器上快捷简单自动化合成18F-AV45，经药物质量控制和伦理审批后，并进行初步临床验证。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器

RDS111型回旋加速器：美国CTI公司；TRACERlab FX2 N合成器：美国GE公司，配S1122泵(德国Sykam公司)，DETECTOR 10D紫外检测器及放射性检测器；1260 Infinity Ⅱ液相色谱仪：美国Agilent公司，配1260紫外检测器，Flow-RAM放射性HPLC流量检测器；PoleStar m660型PET/CT扫描仪：赛诺联合医疗科技(北京)有限公司。

1.2 主要试剂

H218O(丰度≥97%)：美国剑桥同位素实验室公司；氨基聚醚(kryptofix，K2.2.2)：德国ABX公司产品；无水二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司；乙腈(色谱级)：美国Fisher公司；乙醇(药用级)：湖南湘易康制药有限公司；18F-AV45前体AV105及对照品19F-AV45：江苏华益科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。Sep-Pak Plus Light QMA、Sep-Pak C18柱：美国Waters公司；InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4 μm，4.6 mm×100 mm)：美国Agilent公司；VP 250/10 NUCLEOSIL 100-5 C18半制备色谱柱：德国MN公司；Millex-GV 0.22 μm除菌过滤器：美国Millipore公司。

1.3 实验动物

ICR小鼠，12只，雌雄各6只，体重18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物实验经过北京协和医院伦理审查委员会批准，伦理批准号：JS-2628。

2 实验方法

2.1 18F-AV45合成

在TRACERlab FX2 N合成器上进行18F-AV45合成，合成路线示于图1。首先以AV105为前体，与18F-发生亲核反应形成18F-AV45-Boc后，再依次经酸水解及碱中和，经HPLC分离后经固相萃取获得可供注射的18F-AV45。

图1 18F-AV45合成路线图Fig.1 Synthesis of 18F-AV45

2.2 TRACERlab FX2 N合成器合成步骤

TRACERlab FX2 N合成器由管路系统、负压泵系统、气液传输系统、加热及冷却系统、HPLC系统(含流动相，进样环，HPLC泵，C18制备柱，紫外探测器及放射性检测器)及计算机控制系统等组成，图2为TRACERlab FX2 N合成器示意图，图中A点与B点短接。

图2 TRACERlab FX2 N合成器示意图Fig.2 Schematic of the TRACERlab FX2 N radiosynthesis module

TRACERlab FX2 N合成器的具体合成步骤如下。(1)18F-制备。加速器经18O(p，n)18F反应得到18F-，并经靶水线传送到靶水瓶，由氦气载带至QMA柱并被捕获；然后1号试剂瓶中K2CO3/K2.2.2乙腈水溶液1.5 mL(1 mL含15 mg K2.2.2乙腈溶液+0.5 mL含3 mg K2CO3水溶液)淋洗QMA柱，洗脱18F-至反应管。反应管通入氦气并60 ℃加热3分45秒后再90 ℃加热1分45秒将液体除干，得到无水18F-。(2) 亲核反应。2号试剂瓶中前体溶液(4 mg AV105溶于1 mL DMSO)在氦气载带下进入反应管，130 ℃加热反应10 min完成标记。(3) 水解反应。将4号试剂瓶中0.8 mL 3.33 mol/L HCl溶液加入反应管，130 ℃反应5 min，进行水解。(4) 酸碱中和反应。水解后将5号试剂瓶中1.35 mL 2 mol/L NaOH溶液及6.65 mL 4%醋酸铵溶液分别加入反应管，中和混匀。(5) 固相柱纯化。将反应管中液体通过C18 1柱(Sep-Pak C18柱)至废液，用6号试剂瓶中10 mL注射用水冲洗C18 1柱，然后用3号试剂瓶中1.5 mL乙腈将C18 1柱上粗产品洗入TUBE管。(6) 半制备柱分离。粗产品进行HPLC分离，流动相为乙腈-20 mmol/L醋酸铵溶液，体积比45∶55，流速为6 mL/min，紫外检测波长350 nm，收集产品至装有30 mL注射用水的稀释瓶，稀释混匀。(7) 溶剂转换。将稀释瓶液体经C18 2柱(Sep-Pak C18柱)转移至废液瓶，然后用10 mL注射用水(9号试剂瓶)清洗C18 2柱，再用1 mL乙醇(10号试剂瓶)将产品从C18 2柱上洗脱至产品瓶，并用9 mL生理盐水(12号试剂瓶)稀释，最后通过无菌滤膜得到终产品。

2.3 18F-AV45的质量控制

(1) 外观。通过铅玻璃观察产品的颜色和澄明度。

(2) pH。用精密pH试纸测定18F-AV45产品的pH。

(3) 产品鉴别。取18F-AV45产品适量，照半衰期测定法(《中国药典》2020年版第四部通则1401)测定核素半衰期。利用分析型HPLC测定18F-AV45产品的放化纯度，同时用标准品19F-AV45(50 μg/mL)进行比对分析，流动相为乙腈-20 mmol/L醋酸铵溶液，体积比40∶60水溶液，流速为1 mL/min，紫外波长350 nm。

(4) 无菌和内毒素。参照2020版《中国药典》对产品注射液进行无菌和细菌内毒素检查。

(5) 异常毒性检查。取ICR小鼠12只，其中6只为实验组，6只为对照组，实验组小鼠尾静脉注射18F-AV45产品5.55×107Bq，对照组小鼠注射相同体积生理盐水，5 s内匀速注射完毕，正常饲养，观察48 h内是否正常。

(6) 残留溶剂检查。使用碘铂酸钾方法测定K2.2.2，使用气相色谱仪检测18F-AV45产品的乙腈及DMSO含量。

2.4 18F-AV45体外稳定性

将370 MBq/mL18F-AV45产品溶液平均分成两份，第一份不添加任何试剂，第二份中加入0.5%抗坏血酸钠。用分析型HPLC分别测定原液和加入抗坏血酸钠产品于0、2、4及6 h的放化纯度，比较有无抗坏血酸钠对18F-AV45稳定性的影响。

2.5 临床PET/CT显像

经医院伦理委员会同意(伦理审查批件编号：JS-2423)，健康对照者：女性1例，56岁；临床拟诊为AD患者：女性1例，50岁，分别签署知情同意书。

AD患者及健康对照者分别行简易智力状态检查量表(mini-mental state examination,MMSE)评分，静脉注射18F-AV45 3.7×108Bq，注射药物80 min后行头部1床位PET/CT显像，采集时间10 min。AD患者及健康对照者分别行低剂量CT扫描(120 kV，100 mAs，螺距1.3，层厚2.5 mm)用于衰减校正。图像处理在MIM工作站用有序子集最大期望迭代(ordered subset expectation maximization, OSEM)算法(迭代次数2，子集10，矩阵192×192)及飞行时间(time of flight, TOF)技术进行图像重建，行CT、PET图像显示与PET/CT融合。

3 实验结果

3.1 18F-AV45的自动化合成

本研究利用18F-AV45的标记前体AV105在TRACERlab FX2 N合成器上自动化合成18F-AV45，在半制备HPLC上收集19 min左右的放射峰(图3)，该方法合成时间从加速器轰击结束开始到最终18F-AV45产品共耗时约80 min，不校正合成效率为(17.02±1.52)%(n=6)，比活度为2.22 TBq/mmol，合成稳定性和可靠性高。

图3 18F-AV45半制备HPLC放射性图谱Fig.3 Radioactive chromatogram of semi-prep HPLC

3.2 18F-AV45的质量控制

得到的18F-AV45产品呈无色澄清，pH为6～7，核素半衰期为110 min，用分析型HPLC检测放化纯度，图4分别为18F-AV45产品及标准品19F-AV45在分析型HPLC中放射性检测图谱和紫外图谱，保留时间分别为11.51 min及11.28 min，18F-AV45产品与其标准品的相对保留时间基本一致，因此，合成产物为目标18F-AV45化合物，且其放化纯度大于95%。18F-AV45产品内毒素含量低于15 Eu/mL且14 d细菌培养结果显示无菌生长。此外，实验组和对照组ICR小鼠注射后48 h全部存活，未见异常毒性反应。K2.2.2含量小于50 μg/mL，乙腈含量小于0.041%，DMSO含量小于0.5%，因此，18F-AV45产品的无菌检测、细菌内毒素检测、异常毒性检测、溶剂残留乙腈及DMSO含量均符合《中国药典》(2020年版)要求。

图4 18F-AV45产品的放射性检测图谱(a)及标准品19F-AV45的紫外图谱(b)Fig.4 Radioactive chromatogram of formulated 18F-AV45 (a) and the UV chromatogram of 19F-AV45 (b)

3.3 18F-AV45体外稳定性

18F-AV45体外稳定性研究表明，当终产品加入0.5%抗坏血酸钠并放置6 h后，其放化纯度仍然大于95%，而不含抗坏血酸钠的终产品放置0、2、4及6 h后，其放化纯度逐渐下降，分别为96.42%、90.06%、81.15%及71.07%，所以，18F-AV45放射性药物易发生辐射分解，可在终产品中加入0.5%抗坏血酸钠用于防止产品辐射分解。

3.4 临床应用

AD患者50岁，女性，无明显诱因推理能力、记忆力下降8个月，MMSE评分29分，18F-AV45 PET/CT显像表明：大脑皮层摄取弥漫增高，提示大脑皮层β淀粉样蛋白沉积(图5a)。健康对照者，56岁，女性，18F-AV45 PET/CT显像表明：大脑皮层未见明显摄取，即大脑皮层未见β淀粉样蛋白沉积(图5b)。

a1、b1—PET显像图；a2、b2—CT显像图；a3、b3—PET/CT融合显像图图5 AD患者(a)和健康对照者(b)18F-AV45脑显像图Fig.5 18F-AV45 brain imaging was performed in an AD patient (a) and a healthy person (b)

4 讨论

目前，国内合成18F-AV45所用的化学合成模块以国产PET-MF-2V-IT-I氟多功能合成模块为主，还未有国内外文献报道过采用进口氟多功能合成模块TRACERlab FX2 N合成器开展18F-AV45的制备工作，而本研究建立了一种适用于进口氟多功能合成模块TRACERlab FX2 N合成器合成Aβ显像剂18F-AV45的方法，可为其他研究者采用TRACERlab FX2 N合成器合成18F-AV45提供参考和依据。该方法以AV105为前体，进行18F-标记，制备出的18F-AV45产品无色澄清、pH为6～7及放化纯度大于95%，其无菌检测、细菌内毒素检测、异常毒性检测、溶剂残留乙腈及DMSO含量均符合2020版《中华人民共和国药典》标准，能够满足临床科研要求，对推动国内18F-AV45在临床上的应用具有较大的意义。

采用TRACERlab FX2 N合成器合成18F-AV45，在加热系统方面，与国产氟多功能用的风加热系统相比，该合成器采用铜加热套直接加热，加热效率高，温控更准更稳定。TRACERlab FX2 N合成器的整个合成过程在真空状态下采用液氮冷阱迅速捕获合成器内废气，体积小且可防止有机溶剂及放射性气体蒸出，同时反应中除水效率更高。国产氟多功能合成模块采用气囊收集放射性废气，因此对气囊气密性要求高，否则放射性废气容易蒸出到环境中，造成环境辐射剂量升高，且与液氮冷阱相比，气囊在收集废气时体积变大，在合成热室内占据更大的空间。但与国产氟多功能合成模块相比，TRACERlab FX2 N合成器成本更高，价格昂贵。

然而，本研究18F-AV45不校正合成效率为(17.02±1.52)%(n=6)，而多数文献报道的不校正合成效率在20%以上[6,8-9]，为了获得更高的合成效率，将在后续研究中对反应前体量、前体溶剂、反应温度及反应时间等合成条件进行优化，摸索出适用于TRACERlab FX2 N合成器合成18F-AV45的最佳合成方法。