LINC00599靶向miR-210对直肠癌细胞增殖、凋亡的影响

廖超 张荣枝 李毅忠

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率、病死率在全球癌症中分别高居第三位、第四位[1]。直肠癌是结直肠癌的主要类型，尽管包括手术切除、化疗和放疗在内的多种治疗手段都取得了进展，但直肠癌的长期生存仍不令人满意，尤其是局部进展期和远处转移患者[2,3]。因此，迫切寻找有效的诊断或治疗靶点、开发新的治疗方法已迫在眉睫。长链非编码RNA(long noncoding rna,lncRNAs)是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其通过调控细胞生长、分化、转移、凋亡和多重耐药等过程在肿瘤发生中具有致癌或抑癌作用[4,5]。LINC00599是一种保守的基因间非编码RNA，最初被认为是视网膜发育过程中神经元和少突胶质细胞分化的潜在调节因子[6]。近年研究显示，胶质瘤组织、细胞系中LINC00599表达下调，LINC00599低表达与较差的无病生存和总生存相关，上调LINC00599通过调节上皮-间质转化转化对胶质瘤细胞的迁移和侵袭具有显著的抑制作用[7]。然而，LINC00599在直肠癌中的作用尚不明确。本研究通过分析直肠癌组织中LINC00599表达情况，探讨LINC00599对直肠癌细胞增殖和凋亡的影响，以期为直肠癌诊疗提供有效靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2016年10月至2018年5月于我院就诊并确诊为直肠癌患者的31例手术切除癌组织样本及与其对应的距离肿瘤边缘>2 cm的正常组织样本。患者均未进行术前放疗、化疗。本研究获得我院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 SW480细胞购于中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养液、青链霉素双抗、胎牛血清为北京索莱宝公司产品；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白试剂盒购于江苏康为世纪；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂、二甲基亚砜、放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解缓冲液购于上海碧云天公司；pcDNA3.1-LINC00599(LINC00599过表达载体)、pcDNA3.1(空载质粒)、miR-210抑制剂(anti-miR-210)、抑制剂阴性对照(anti-miR-NC)、miR-210模拟物(miR-210 mimics)、mimics物阴性对照(miR-NC)由构建上海生工公司完成。膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自南京科元生物公司；兔源Ki67、半胱氨酸蛋白酶3(pro-caspase-3)和裂解的caspase-3(cl-caspase-3)、磷酸甘油醛脱氢酶(磷酸甘油醛脱氢酶，GAPDH)抗体，二抗山羊抗兔IgG购于上海赛信通生物技术公司。

1.3 RT-qPCR检测LINC00599和miR-210表达水平 利用TRIzol试剂从直肠癌组织、癌旁组织和SW480中提取总RNA。按照逆转录试剂盒合成cDNA，利用SYBR Green Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis试剂盒分别测定LINC00599(GAPDH)和miR-210(U6)表达水平，2-ΔΔCT法计算二者相对表达量。LINC00599上游5’-CAACACCTTCCTCCGTGACTGTG-3’，下游5’-GCTGGCTCCTTCTTGTCCACATA-3’；GAPDH上游5’-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3’，下游5’-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’；miR-210上游5’-CGCCTGTGCGTGTGACAGCG-3’，下游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.4 细胞培养与分组 SW480细胞采用RPMI-1640培养基(添加10%胎牛血清、1%的青链霉素双抗)在37℃、5% CO2、湿润培养箱中培养。常规传代、换液。取对数期SW480细胞按照2×104cells/孔密度接种6孔板，细胞融合50%时，按照脂质体转染试剂说明书进行细胞转染，将细胞分为pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00599、anti-miR-NC、anti-miR-210、pcDNA3.1-LINC00599+ miR-NC和pcDNA3.1-LINC00599+ miR-210组。转染48 h时按照1.2步骤检测转染效果，随后进行其他指标检测。

1.5 MTT法检测细胞活力 转染48 h后，收集SW480细胞，采用RPMI-1640培养液制备单细胞悬液。单细胞细胞密度为3×104cells/mL的。取100 μl细胞悬液(3×103个细胞)加入到96孔板，常规培养48 h时，每孔添加质量浓度为5 mg/ml的MTT试剂20 μl，反应4 h后，弃去孔内培养液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜，摇床低速振荡10 min后，酶标仪检测490 nm处各孔光密度(optical density，OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%

1.6 集落形成实验检测细胞克隆能力 取对数期细胞，制备单细胞悬液。取5 ml细胞悬液(2×102个细胞)接种到直径为60 mm培养皿中，米字方向轻轻晃动培养皿使细胞均匀分散。常规培养2周，当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS小心浸洗2次，干燥后进行甲醇固定和结晶紫染色，显微镜下计数>50个细胞的克隆数。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 转染48 h后，收集SW480细胞，采用1×结合缓冲液制备细胞密度为1×105cells/mL的单细胞悬液。取100 μl细胞悬液加入至流式管内，分别加入5 μl的Annexin V-FITC和PI，避光反应15 min，补加1×结合缓冲液至500 μl，轻轻混匀，立即上机检测细胞凋亡情况。

1.8 Western blot检测Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表达 转染48 h后，收集SW480细胞，用RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白，BCA蛋白试剂盒测定蛋白样品浓度。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白样品，并湿法转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶室温封闭膜2 h后，用稀释的一抗溶液孵育膜2 h。冲洗后，将膜与二抗在室温下孵育2 h。增强化学发光法进行显色，以GAPDH为内参，Quantity One软件分析相对灰度值。

1.9 双荧光素酶报告基因实验 合成含有miR-210结合位点的LINC00599野生型序列或突变位点的突变序列，并将野生型/突变型LINC00599序列克隆到pmirGLO双荧光素酶载体构建成WT/MUT-LINC00599，该步骤由上海生工生物工程公司完成。利用Lipofectamine 2000将报告载体WT-LINC00599或MUT-LINC00599分别与miR-210 mimic或miR-NC共转染至SW480细胞，转染48 h时，使用双荧光素酶报告基因测定系统测定各组SW480细胞的荧光素酶活性。

2 结果

2.1 LINC00599在直肠癌中的表达 RT-qPCR检测显示，直肠癌组织中LINC00599的表达量为(0.23±0.03)，与癌旁组织LINC00599表达量(1.00±0.06)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 过表达LINC00599对SW480增殖凋亡的影响 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-LINC00599组SW480细胞LINC00599的表达水平升高，提示已成功上调SW480细胞中LINC00599的表达水平。过表达LINC00599后SW480细胞存活率、克隆形成数、Ki67和pro-caspase3蛋白表达、miR-210表达均降低，细胞凋亡率、cl-caspase3蛋白表达均升高(P<0.05)。见图1,表1。

图1 过表达LINC00599对SW480凋亡及Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表达的影响;A 过表达LINC00599对SW480凋亡影响；B Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白的表达

表1 过表达LINC00599 对SW480 增殖凋亡的影响

2.3 LINC00599靶向miR-210 生物信息分析显示，LINC00599与miR-210之间存在互补的连续结合位点。双荧光素酶报告实验显示，miR-210 mimics和WT-LINC00599共转染组SW480细胞的荧光素酶活性较miR-NC和WT-LINC00599共转染组降低(P<0.05)；miR-210 mimics和MUT-LINC00599共转染组SW480细胞的荧光素酶活性较miR-NC和MUT-LINC00599共转染组无显著变化。见表2，图2。

表2 双荧光素酶报告实验

2.4 抑制miR-210对SW480增殖凋亡的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-210组SW480细胞miR-210的表达显著降低，提示转染anti-miR-210后SW480细胞中miR-210表达受到抑制。抑制miR-210表达后SW480细胞存活率、克隆形成数、Ki67和pro-caspase3蛋白表达、miR-210表达均降低，细胞凋亡率、cl-caspase3蛋白表达均升高(P<0.05)。见图3,表3。

图2 LINC00599靶向miR-210

2.5 抑制miR-210能逆转LINC00599对SW480增殖凋亡的影响 与pcDNA3.1-LINC00599+ miR-NC组比较，pcDNA3.1-LINC00599+miR-210组SW480细胞miR-210表达、细胞存活率、克隆形成数、Ki67和pro-caspase3蛋白表达均升高，细胞凋亡率、cl-caspase3蛋白表达均降低(P<0.05)。见图4，表4。

图3 抑制miR-210对SW480凋亡及Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表达的影响;A 抑制miR-210对SW480凋亡影响；B Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白的表达

表3 抑制miR-210 对SW480 增殖凋亡的影响

图4 miR-210能逆转LINC00599对SW480凋亡及Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白表达的影响;A miR-210能逆转LINC00599对SW480凋亡影响；B Ki67、pro-caspase3、cl-caspase3蛋白的表达

表4 miR-210 能逆转LINC00599 对SW480 增殖凋亡的影响

3 讨论

近年来，LINC00599在人类疾病中的作用引起科学家的广泛关注。研究显示，LINC00599参与动脉粥样硬化、糖尿病相关视网膜血管功能障碍[8,9]。LINC00599还可促进髓源性抑制细胞分化，抑制细胞功能，参与免疫反应[10]。此外，LINC00599在人类肿瘤发生中具有重要作用。Morandi等[11]研究发现，与正常口腔黏膜组织比较，口腔鳞状细胞癌组织和高级别鳞状上皮病中LINC00599表现为过渡甲基化。Zhang等[12]证实胶质母细胞瘤LINC00599表达下调，上调其表达可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡发挥抑癌基因作用。然而，在前列腺癌中LINC00599表达上调，LINC00599高表达与肿瘤进展和较差的生存率显著相关，敲除LINC00599可抑制前列腺癌细胞的增殖、集落形成和侵袭能力[13]。本研究显示直肠癌组织中LINC00599表达显著降低。进一步功能分析显示，过表达LINC00599可降低SW480细胞的存活和集落形成能力，抑制Ki67、pro-caspase3表达，促进clv-caspase-3表达，促进细胞凋亡。以上数据表明LINC00599在直肠癌中具有抑癌功能。

研究显示，lncRNAs调控下游靶miRNA表达是其发挥功能的重要机制[14]。本研究通过生物信息学分析发现miR-210是LINC00599的下游潜在靶基因，并通过荧光素酶报告基因实验确定LINC00599对miR-210的靶向作用。此外，RT-qPCR显示过表达LINC00599可降低miR-210的表达水平。既往研究显示，乳腺癌组织中miR-210表达上调，miR-210高表达可促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的恶性生物学行为[15]。恶性黑色素瘤miR-210亦存在高表达，体外抑制miR-210可下调基质金属蛋白酶表达，进而抑制A375细胞的转移能力，是潜在的分子靶向治疗位点[16]。此外，结直肠癌患者血清miR-210高表达与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移、临床分期密切相关，循环miR-210是结直肠癌患者早期诊断的潜在生物标志物[17]。本研究表明抑制miR-210表达后SW480细胞的存活率、集落形成能力、Ki67和pro-caspase3蛋白表达显著降低，凋亡率、cl-caspase-3蛋白表达增加，与过表达LINC00599的抑癌作用一致。进一步恢复实验显示，过表达miR-210可逆转LINC00599对SW480细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响。提示LINC00599通过靶向下调miR-210在直肠癌中发挥作用。

综上所述，本研究首次揭示LINC00599在直肠癌组织中表达降低，并证实LINC00599通过靶向抑制miR-185-5p可抑制直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。因此，LINC00599有望成为未来临床直肠癌治疗的生物学靶点。