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马铃薯内生真菌中丁烯内酯类化合物诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制

2021-08-13黄蓉伍兴张娴艾洪莲

关键词:孵育化合物培养基

黄蓉,伍兴,张娴,艾洪莲

(中南民族大学 药学院 & 民族药学国家级实验教学示范中心,武汉 430074)

肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的疾病之一,抗肿瘤药物不计其数,其作用机制也各不相同,其中诱导肿瘤细胞凋亡被认为是癌症药物治疗的有效途径. 调控细胞凋亡的通路主要有3种:线粒体通路、内质网通路和激活死亡受体通路. 研究表明,3条凋亡通路相互联系,相互调控,最终都会通过激活caspase级联反应引起细胞凋亡[1-2].

植物内生真菌是与植物共生而不引起植物病变和排斥的真菌[3],在与植物共同进化的过程中能产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物. 这些次生代谢产物结构新颖多样,生物药理活性丰富, 是药物筛选的天然宝库[4-5].α-丁烯内酯是一类广泛存在于天然产物的活性单元,其衍生物具有抗氧化、抗菌、抗炎和抑制α-葡萄糖苷酶等多种生物活性[6-8]. 在前期研究中,从马铃薯内生真菌Aspergilluscarneus中分离得到一系列丁烯内酯类化合物[9],其抗肿瘤活性未见报道. 因此,本文以人乳腺癌细胞株MCF-7细胞为研究对象,用MTT法检测这一类化合物抗肿瘤活性,初筛后选取了活性较好的化合物Asperteretal D(图1),本文就其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制展开研究.

图1 化合物Asperteretal D结构Fig.1 Structure of compound Asperteretal D

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人乳腺癌细胞株MCF-7(武汉大学典型培养物保藏中心CCTCC);胎牛血清(浙江天杭),DMEM、胰蛋白酶(美国Hyclone);MTT(美国Sigma); GAPDH兔多抗(武汉三鹰)、PARP兔多抗、Caspase-9兔多抗、Caspase-3兔多抗、Active Caspase-3兔单抗、P53兔多抗、蛋白质分子量标准(武汉爱博泰克);HRP-山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量试剂盒、BSA、ECL显色液、Annexin V/FITC-PI试剂盒(上海碧云天);PVDF膜(美国Millipore).

CO2培养箱(美国Thermo Scientific),倒置显微镜(日本Nikon),多功能酶标仪(瑞士Tecan Spark),台式机冷冻离心机(德国Eppendorf),凝胶成像系统(美国Bio-Rad),脱色摇床(北京六一),高压灭菌锅(上海博迅),细胞培养瓶及细胞孔板(美国Corning),,流式细胞仪(美国BD),蛋白电泳转膜装置(美国Bio-Rad).

1.2 细胞培养与细胞活力检测

MCF-7细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基,在37 ℃,5% CO2培养箱中培养. 取对数生长期细胞,以1×104个/孔接种到96孔板中,每孔100 μL,培养6~7 h后待其贴壁后进行分组处理. 使用无血清培养基将化合物Asperteretal D配制成0.25、1、2、5、8和13 μM浓度的工作液. 空白组:加入无血清培养液;给药组:分别加入不同浓度的Asperteretal D工作液,每孔100 μL,每组3个复孔. 孵育24 h后弃掉旧培养基,每孔加入100 μL的0.5 mg/mL的MTT试剂,培养4 h,弃上清,加入100 μL DMSO溶解紫色结晶,10 min后,用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光度,进行数据分析. 细胞存活率=给药组/空白组×100%.

1.3 细胞凋亡检测

取对数生长期细胞,以1×105个/孔接种到六孔板中,6~8 h后待细胞贴壁,弃去旧培养基,加入无血清培养基配制的Asperteretal D溶液,终浓度为0、3.5、7和14 μM. 在培养箱中培养24 h后将细胞收集至1.5 mL EP管中. 用无菌PBS充分洗涤细胞沉淀2次,弃去上清后加入195 μL染色结合液,充分重悬细胞,双染样品中添加5 μL AnnexinV-FITC 染色液和10 μL PI染色液,充分混匀,避光室温孵育15 min后上流式细胞仪进行检测.

1.4 分子对接

从蛋白数据库(www.rcsb.org)得到PARP、Caspase-3、Caspase-9、P53、Bcl-2和Bax蛋白的X射线晶体结构,作为分子对接受体. 通过 Sybyl-X 2.0 制备Asperteretal D的三维结构,利用标准的tripos力场对Asperteretal D分子进行能量最小化,通过标准程序制备蛋白质晶体结构,去除结合配体和水后生成活性位点[10]. 基于对接模型,对化合物Asperteretal D进行结合分析,并预测对接分数. 采用DS软件中Receptor-Ligand Interactions模块对分子对接结果进行分析,并制作二维效果图.

1.5 蛋白免疫印迹法测定蛋白表达

取对数生长期MCF-7细胞,以1×105个/孔接种到六孔板中6~8 h后待细胞贴壁,弃去旧的培养基,加入新鲜无血清培养基1 mL,细胞分组及处理方法同1.3. 待培养结束后弃上清,用胰酶将细胞消化收集至1.5 mL的EP管中,用预冷PBS洗涤3次,使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解蛋白. 离心取上清,按照BCA蛋白定量试剂盒的操作说明对所提取的蛋白进行定量. 加入蛋白上样缓冲液,煮沸5 min使蛋白变性,采用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离蛋白,再将蛋白转至PVDF膜上,用5% BSA在室温下封闭,1 h后加入一抗,于4 ℃下孵育过夜. TBST缓冲液洗膜,加HRP-山羊抗兔二抗孵育1 h后进行ECL显影. 以GAPDH为内标,定量分析各组细胞中蛋白的表达情况.

1.6 统计学分析

所有实验至少重复3次,实验数据以¯x±s的形式表示,采用 GraphPad Prism 8软件进行数据分析,组间比较采用单因素方差法对实验数据进行统计学分析,P<0.05时认为差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 化合物Asperteretal D对细胞活力的影响

MCF-7细胞与不同浓度的化合物Asperteretal D共孵育24 h后,MTT实验结果如图2. 图中随着化合物浓度的升高,细胞存活率逐渐下降,非线性拟合后计算出IC50=(6.39±0.21) μM,表明化合物Asperteretal D对MCF-7细胞的增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性.

图2 Asperteretal D对MCF-7细胞活力的影响Fig.2 Effect ofAsperteretal D on the viability of MCF-7 cells

2.2 化合物Asperteretal D对细胞凋亡的诱导作用

流式细胞术实验表明(图3),随着化合物浓度的升高,MCF-7细胞的早期凋亡和晚期凋亡总比例逐步增加,凋亡率从12.26%(空白组)升至14.03%、19.12%和37.2%,7 μM和14 μM Asperteretal D均能显著地诱导细胞凋亡(P<0.01).

图3 Asperteretal D对MCF-7不同阶段凋亡的影响Fig.3 Effect of Asperteretal D on apoptosis of MCF-7 at different stages

2.3 化合物Asperteretal D与细胞凋亡相关蛋白的分子对接

为研究化合物Asperteretal D与凋亡相关蛋白的作用方式,通过分子对接模拟计算其结合模式,对接结果以反映蛋白与配体亲和力大小的Total Score呈现(表1),Total Score是评价小分子配体与蛋白受体结合强弱的标准,评分越高表示配体与受体的亲和能力越好(total-score≥7.5)[11]. Bcl-2家族蛋白主要存在于细胞的线粒体外膜,是细胞凋亡重要调节因子,主要有促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2,两者相互作用共同调控细胞因子从线粒体中释放[12]. 计算结果显示,化合物Asperteretal D能够有效与Caspase家族蛋白、Bcl家族蛋白和P53蛋白结合,从而激活肿瘤细胞凋亡通路(图4).

表1 Asperteretal D与不同蛋白分子对接结果评分

图4 Asperteretal D与蛋白分子对接二维图Fig.4 Two-dimensional diagram of docking between Asperteretal D and proteins

2.4 化合物Asperteretal D对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

由图5可知,MCF-7细胞与14 μM化合物Asperteretal D孵育24 h后,胞内的pro Caspase-9、pro Caspase-3和PARP-1蛋白表达量均显著减少(P<0.05),表明Asperteretal D启动了细胞内的Caspase级联反应,使得Caspase-9发生自我剪切,随即活化凋亡执行者Caspase-3,切割靶蛋白底物PARP-1,最终导致细胞凋亡. 当细胞受到外界刺激后产生应激反应,线粒体膜通透性改变,细胞色素C释放到胞质中[13],与Apfa-1、pro Caspase-9结合形成凋亡小体[14],并进一步活化下游的凋亡执行者Caspase-3[15],剪切包括PARP-1、DNA-PK、U1-70 kD在内的多种凋亡相关蛋白. 多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)是一种多功能的蛋白质翻译后修饰酶, 在DNA突变损伤修复以及维持基因组稳定性中起着至关重要的作用[16]. 当PARP-1被Caspase-3剪切后丧失基因修复能力, 细胞活性受到抑制而凋亡.

P53是乳腺癌中最常见的突变基因, 其编码的P53蛋白参与调控细胞周期和DNA修复,可通过线粒体通路和死亡受体途径干扰Caspase信号转导并诱导细胞凋亡[17-18]. 图5显示,化合物Asperteretal D能显著上调P53蛋白的表达.

图5 Asperteretal D对凋亡相关蛋白表达量的影响Fig.5 Effect of Asperteretal D on the expressions of apoptosis-related proteins

3 结语

马铃薯内生真菌次生代谢产物丁烯内酯类化合物Asperteretal D能有效抑制MCF-7细胞的增殖,通过激活Caspase级联反应并调控P53蛋白的表达,引起肿瘤细胞凋亡. 不过,虽然分子对接实验模拟了化合物Asperteretal D与细胞凋亡相关蛋白的结合模式,但其关键作用靶点还有待进一步明确.

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