纤维脱胶菌RJ6的筛选及脱胶性能

曾晓希 冉 松 谭 琴

徐 鸿 张远科 陈启明

马 靓

湖南工业大学

生命科学与化学学院

湖南 株洲 412007

1 研究背景

随着造纸技术与产业的不断发展，造纸原料供应紧缺的问题在世界范围内日益严重[1]。为解决造纸原料缺乏和造纸工业产生的环境问题，需要尽快调整造纸原料结构，加大对非木材纤维原料利用的研究[2]。目前，韧皮纤维类的非木材长纤维原料由于其纤维细长且柔韧、生长周期短、适应性好等优点，具有良好的应用前景。但在制浆造纸工艺中，植物纤维原料含有大量多糖胶状物质，其纤维长且坚韧不易断，使其在造纸和纺织方面的应用受到了限制。为了解决这一问题，需要对植物纤维原料进行脱胶预处理，即对原料进行胶质去除，并使植物纤维的束纤维或者单纤维相互分离[3-4]。传统的脱胶工艺设计采用烧碱蒸煮的化学法，但这种方法对环境污染严重、耗能高、处理后的纤维有不同程度的损伤，这些均与日益完善的现代工业发展要求不符[5-7]。随着大量研究人员的不断努力，生物预处理技术不断完善，这些技术主要利用微生物代谢物中产生对应的酶来分解植物韧皮部纤维中的果胶、半纤维素等物质，整个反应条件温和、能耗低、符合绿色环保发展的要求且不会破坏纤维素结构[8-12]。生物预处理方式一般主要包括生物酶法和生物菌法，两者的关键都在于对微生物的筛选和特性研究[4,10,13]。目前针对此类目标微生物，一般有两种方法，一是利用果胶作为营养物质配制培养基；二是采用植物纤维如剑麻叶、苎麻粉、大麻茎等为原料直接筛选的方法，利用该方法可以筛选出以底物为营养物质，并能分解果胶、半纤维素等成分代谢物的各类微生物。但在处理过程中，能分解纤维素的微生物会对麻类的纤维品质造成一定的影响和破坏，所以通过这种方法筛选出的微生物是否可以应用还有待考究[9,14-15]。

已有研究表明微生物应用于生物预处理方法是可行的，如Bajpai.P等[16]利用Ceriporiopsis subvernispora对麦草进行预处理，然后再进行制浆，处理后的实验组木素含量达到和对照组的相同时，可节约30 kg碱，且污水的化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）负荷比也更低，成本大幅降低。脱胶菌B.Subtilis A2-5以及一种产生韧皮纤维脱胶酶的菌株B.Subtilis No.13，对植物纤维原料的脱胶有一定的效果，但它从斜面菌种到二级种子罐需要培养16～28 h，发酵至产酶需要12～18 h，且脱胶酶液还需要适当处理后才能对原麻脱胶，菌株培养周期长且脱胶时间较长的缺点难以解决，阻碍了它在脱胶领域的应用[17-18]。为此，本研究拟以麻类纤维为实验材料，通过筛选一种高效的脱胶菌株，对原变种生苎麻进行脱胶，以期为植物纤维原料的预处理提供新方法和技术参考。

2 实验

2.1 材料

2.1.1 菌种来源

将腐烂菜样（包括青菜、番茄、白菜和胡萝卜等多种腐烂蔬菜）加入无菌水振荡，从振荡后的溶液中筛选菌种。

2.1.2 试剂和样品

磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）、氯化铵（NH4Cl）、测序试剂BigDye Terminator v3.1均为市售分析纯；蛋白胨、牛肉膏为生物试剂；苎麻（Boehmeria nivea(L.) Gaudich）。

2.1.3 培养基

富集培养基：将5 g生苎麻剪成1 cm左右的小段，加入适量水加热，待水沸腾后，降成小火熬煮；当水中苎麻变软，溶液逐渐由澄清变成棕黄色后，将苎麻捞出；在溶液中加入0.3 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl，再将该溶液加水混匀定容到100 mL，在pH自然状态，采用高压蒸汽灭菌20 min。

初筛培养基：将8 g生苎麻按照富集培养基中的方法处理；将苎麻捞出，加入0.03 g K2HPO4、0.05 g NH4Cl、2 g琼脂，将该溶液加水混匀定容到100 mL，在pH自然状态，采用高压蒸汽灭菌20 min。

纯化培养基：将0.3 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl、2 g琼脂，加水混匀将溶液定容到100 mL，将pH调至7.0，采用高压蒸汽灭菌20 min。

复筛培养基：加入0.03 g K2HPO4、0.05 g NH4Cl，将该溶液加水混匀定容到100 mL，然后加入10 g生苎麻，在pH自然状态，采用高压蒸汽灭菌20 min。

2.2 实验方法

2.2.1 脱胶菌株的富集驯化

在装有20 mL无菌水的200 mL三角瓶中加入1 g腐烂菜样，同时加入适量无菌玻璃珠，在转速150 r/min的摇床中摇动20 min，尽量使其混合均匀。移取振荡后的溶液10 mL，在100 mL液体培养基中进行接种，然后在转速170 r/min、温度35 ℃的条件下培养48 h。

2.2.2 脱胶菌株的筛选

首先稀释上述富集驯化后的混合物，在以苎麻汁为唯一营养物质的培养基平板上进行涂布，在35 ℃的条件下培养48 h。若产生水溶圈，则在周围挑取菌种，将其置于肉汤培养基平板上进行平板划线，然后置于35 ℃条件下培养48 h，此操作重复3次以上，直至连续多次观察到形态单一的菌体。将上述菌株接种于以苎麻为营养物质的复筛培养基中，在35 ℃、转速180 r/min条件下培养24 h，对复筛培养基中的苎麻进行脱胶率检测，超过80%则认为脱胶能力显著，然后从筛选出的菌株中挑取效率最好的一株作为最优的目的菌株。

2.2.3 菌株的鉴定

1）形态特征观察。利用菌株在不同的固体培养基的平皿上会有不同形态的特点，涂布菌株后在28℃的条件下培养48 h，然后对菌落的特点进行观察。参考中华根瘤菌的筛选方法，取培养至对数生长期的细菌，对其分别进行革兰氏染色、抗酸染色、荚膜染色、芽孢染色和鞭毛染色[19]。在扫描电子显微镜下察看各个细菌形态的大小和特点。

2）菌株的各项生理生化鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》的相应说明进行选择[8]。

2.2.4 16S rDNA的序列分析

参考中华根瘤菌的筛选鉴定[19]，对目的菌株进行16S rDNA分子鉴定。首先，提取目的菌株的基因组，取生长至对数期的菌液，离心后加入RNase和溶菌酶，混和均匀后置于水浴中；在上述样品中加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠（C12H25SO4Na，sodium dodecyl sulfate，SDS），混合均匀；再在混合液中加入十六烷基三甲基溴化铵（C16H33(CH3)3NBr，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）和 NaCl，水浴操作后加入等体积的氯仿/异戊醇，混合均匀后进行离心，弃除沉淀，将上清液移入干净离心管中并加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，再进行离心，弃除沉淀，取上清液；然后加入异丙醇，混合均匀直至DNA沉淀下来，短时间静置后离心，弃上清液，留沉淀；然后用体积分数为70%乙醇将沉淀洗数次，放置片刻使乙醇挥发后加入40 μL ddH2O溶解DNA。最后进行琼脂糖凝胶电泳实验，观察分析电泳结果。然后对目的菌株进行16S rDNA的扩增，使用16S rDNA 的通用引物 63f:5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′和1387r:5′- GGGCGGAGTGTACAAGGC-3′作为引物。配置50 μL的PCR（polymerase chain reaction）反应体系，设置PCR的反应条件参考中华根瘤菌NL的鉴定[19]。获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，剩余PCR产物回收后委托上海生物工程有限公司测序，获得菌株的16S rDNA序列后上传至GenBank数据库，与全部序列进行对照以确定其菌属，并使用系统发育树软件MEGA-X构建发育树。

2.2.5 菌株的脱胶率检测

活化菌种备用，将300 mL自来水和30 g经过预处理的生苎麻在锥形瓶中混合，然后取15 mL菌液接种，在35 ℃、转速170 r/min条件下培养8 h，然后检测脱胶率。对照组为不接种目标菌株，但需要完成同样的处理步骤。脱胶率（Gr）公式为

Gr=1-G1/G0，

式中G0为对照组的含胶率，

G1为实验组的含胶率[13]。

2.2.6 菌株的发酵条件优化

影响RJ6菌株发酵生长水平较为显著的因素有培养温度、pH值，转速和接种量[20]。对上述因素分别进行单因素实验，以菌体数量水平为考察指标，探究其对发酵培养基中菌株生长水平的影响。

3 结果与分析

3.1 脱胶菌株的筛选

用经过纯化后的单一菌株进行脱胶实验，将纯化后的菌种接种到复筛培养基中，然后通过检测培养基中苎麻的含胶率计算每一种菌株的脱胶率。对脱胶率达80%以上的菌株进行筛选，然后将其中效果最优的，即脱胶率达到91%的菌株命名为RJ6。后续实验对象选择RJ6。

3.2 RJ6菌株的形态特征观察

固体培养基的平皿培养特征如图1所示。固体培养基平皿培养的菌株生长较快，菌落呈乳白色的圆状，边缘圆润，轻微隆起，质地不透明但其表面呈光滑状且有光泽，培养36 h后菌落直径达3～5 mm。

图1 菌株RJ6的形态特征照片Fig.1 Morphological characteristics photograph of strain RJ6

RJ6在电子显微镜下的个体形态如图2所示。

图2 菌株RJ6的SEM照片Fig.2 SEM photograph of strain RJ6

从图2的EMS图像可以看出，菌株RJ6整体呈短杆状，两头钝圆，大小为（0.4～0.5）μm ×（1.1～1.8）μm，革兰氏染色结果为阴性，存在鞭毛结构，没有芽孢，不产生色素。

3.3 RJ6菌株的生理生化鉴定

脱胶菌株RJ6的生理生化鉴定结果如表1所示。

表1 RJ6菌株的生理生化鉴定Table 1 Physiological and biochemical identification of RJ6 strain

从表1的鉴定结果可以得到：V-P测定结果为阳性，甲基红实验结果为阴性，说明该菌株可以分解葡萄糖生成丙酮酸；淀粉水解、果胶水解实验结果为阳性，纤维素分解实验为阴性，证明该菌株可以不分解纤维素但分解果胶；葡萄糖利用、乳酸利用、蔗糖利用和麦芽糖利用实验结果都为阳性，说明上述物质皆可以作为唯一碳源使其生长繁殖；在其他生理以及生化指标检测中，该菌株能接触酶，丙二酸利用和柠檬酸盐利用实验结果为阳性，可分解明胶液化，无脲酶活性，不产生荧光色素。

3.4 RJ6 的 16S rDNA 分析

将RJ6的16S rDNA序列上传至GenBank数据库中进行序列对比，登录号为DQ124677。在GenBank数据库中选择同源性高的序列，经由序列同源性分析，结果表明RJ6与GenBank中的欧文氏菌属（Erwinia.sp）的同源性最高，大于99%。欧文氏菌属中分出4个属，其中与RJ6关系密切的是果胶杆菌属（Pectobacterium.sp）。利用系统发育树软件MEGA-X构建发育树，如图3所示。图3所示的菌株RJ6生长发育树也证明了上述结论。再将菌株形态结果、生理生化鉴定结果、序列比对结果和发育树构建结果综合得出RJ6属于果胶杆菌属（Pectobacterium.sp）。

图3 菌株RJ6的生长发育树Fig.3 Growth and development tree of strain RJ6

3.5 菌株的脱胶率测定

根据国家标准GB 5889—1986中公布的苎麻含胶率测定方法，测定对照组的含胶率（G0）和实验组的含胶率（G1）。然后计算实验初筛得到的菌株的脱胶率，其中脱胶率最高的菌株为RJ6，其结果为G0=21.67%，G1=1.95%，脱胶率为91.0%。

将RJ6与湖南师范大学、山东大学和陈其国等筛选出的B.Subtilis A2-5、B.Subtilis No.13和M1脱胶菌株的培养时间、开始产酶时间和脱胶效果进行对比[17-18,21]，结果如表2所示。

表2 RJ6与已发表菌株的脱胶性能对比Table 2 Comparison of degumming performance between RJ6 and published strains

从表2的对比结果可以看出，B.Subtilis A2-5、B.Subtilis No.13菌株的脱胶率高，但培养周期和开始产酶时间长且脱胶酶液还需要进行处理，而M1脱胶菌株培养周期长，脱胶率低。本研究筛选出的目标菌株RJ6在接种到苎麻上后进行恒温振荡8 h，菌株进入对数生长期，开始大量产生脱胶酶，测定其脱胶率可高达91%以上，相比于其他菌株生长周期短，脱胶酶产生的时间快，脱胶率高，整体的脱胶性能良好，且处理后的纤维分散度高，不伤纤维，对生物脱胶领域有着积极的促进作用。

3.6 菌株的发酵条件优化

通过测定在不同条件下的菌体数量水平，对菌株的发酵条件进行优化。脱胶菌株RJ6的发酵条件优化结果如图4所示，实验分别对不同转速、接种量、温度和起始pH下的细菌生长水平进行了测定。

图4 RJ6的条件优化结果Fig.4 Condition optimization results of RJ6

由图4可知，转速在100～160 r/min的范围内菌体数量随着转速的增大而增大，且在160 r/min达到最大值，超过160 r/min后缓慢下降。接种量对菌体数量的影响表现在随着接种量的增大缓慢增大，但在5%～15%接种量的范围内相差不大，均维持在一个较高水平，其中5%接种量为最佳。温度对菌种数量的影响显著，总体趋势是随着温度的增大先增加再减小，35～37 ℃为适宜温度，37 ℃为最佳温度。起始pH的影响需要保持在中性效果最佳，偏酸和偏碱都会影响菌株的生长水平，起始pH 7.0为最佳。综上所述，RJ6菌株在转速为160 r/min、接种量5%、温度37 ℃和起始pH 7.0的条件下保持一个最佳的发酵水平。

4 结论

本研究从腐烂菜堆中筛选得到一株对苎麻具有高效脱胶作用且不损伤苎麻纤维素成分的菌株RJ6。该菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛结构，没有内生芽孢，通过对该菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定，可将该菌鉴定为果胶杆菌（Pectobacterium.sp），菌落呈乳白色圆状，表面光滑且有光泽，细菌个体形态呈短杆状，两头钝圆，大小为（0.4～0.5）μm×（1.1～1.8）μm。通过对 RJ6菌株发酵水平条件进行优化，在转速160 r/min、接种量5%、温度37 ℃和起始pH 7.0的条件下RJ6菌株保持一个高水平的发酵。将菌株RJ6在接种到苎麻上后在优化的条件下培养8 h，可达90%以上的脱胶率。本研究所筛的脱胶菌株RJ6具有生长培养周期短，产生脱胶酶的时间快，脱胶率高的优点，将该脱胶菌应用于苎麻的脱胶处理上，以使苎麻在造纸行业及纺织工业中发挥更大的作用。