不同储藏条件下鲜牛肉特征风味动态变化分析

孟新涛，潘 俨，邹淑萍，乔 雪，张 婷, ，张 谦,

（1.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆乌鲁木齐 830091；2.新疆主要农副产品精深加工工程技术研究中心，新疆乌鲁木齐 830091）

牛肉蛋白质含量高，风味独特，脂肪和胆固醇含量低，容易消化吸收，是集营养和保健于一体的特色肉食品[1−2]。然而，鲜牛肉屠宰后生产、流通及销售等过程中，受外界环境、微生物及自身酶解等因素的影响，极易发生氧化分解，导致其营养、风味及品质变差，造成食用安全性和产品交易价格下降[3−5]。常温货架、冷藏货架及低温货架是目前生产中最常见和最广泛的鲜牛肉流通销售方式，但不同条件下鲜牛肉的储藏时限和食用安全性倍受关注[6−7]。目前，国内外学者多采用针对性较强的理化指标，如pH、色泽、持水力、挥发性盐基氮和菌落总数等指标对不同储藏条件下的牛肉储藏新鲜度、货架期或储藏时限进行评定或判断[8−10]，结果往往受环境、检测方法及主观差异性等因素的影响而造成误判，且常规的感官评定和检测方法无法满足批量检验对评估效率及效果的要求。因此，寻求一种快捷、简单、准确性强的鲜牛肉储藏时限的判断或评估方法具有十分重要的现实意义。

气相离子迁移色谱是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种气体快检技术，该项技术是基于气相中不同离子在电场中迁移速度的差异来对化学离子物质进行表征的一种分析技术[6]。通过整合气相色谱和离子迁移色谱在分离和检测方面的优势，形成具有高分辨率、高灵敏度、分析高效、操作简便等特点的气体快检技术，具有灵敏度高、选择性强、检测过程快速高效等特点[11−12]，已在酒[13]、茶叶[14]、鸡蛋[15]、油[16]及掺假[17−19]等食品研究领域广泛应用，在肉制品掺假检测[20]、指纹图谱构建[21]及冷冻肉储藏时间判断[19]等方面亦被报道，但尚未见在不同条件下鲜牛肉储藏时限判断方面的研究。为此，本项目在预实验的基础上，以排酸后的鲜牛肉为研究对象，定期监测不同储藏条件下产生的挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs），根据其特征性风味物质变化时间点预判鲜牛肉在三种不同条件下的储藏时限，以期为生产中鲜牛肉的流通销售、安全食用和生产监管提供一种快检方法，为其实际应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肉 购买于新疆农业科学院综合试验场，品种为西门塔尔，取新鲜宰杀牛肉后腿部位，4 ℃排酸24 h，每份牛肉样品采集后，由塑料包装袋包裹后放入专用样品取样箱，于1 h内运回新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所肉品分析实验室；2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮等所有分离用有机溶剂Sigma公司。

MQ735绞肉机 日本博朗公司；Flavour Spec气相离子迁移谱联用仪 德国G.A.S公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集及处理 新鲜牛肉切分后模拟三种货架储藏流通温度，货架温度的选择是根据超市、冷鲜肉零售店等销售货柜实际储藏温度所得。分别用A、B、C表示，样品A：25～30 ℃，模拟常温货架；样品B：8～10 ℃，模拟冷藏货架；样品C：0～1 ℃，模拟低温货架。

样品A：模拟常温货架（25～30 ℃），将切割包装后的牛肉置于25～30 ℃常温条件储藏，因储藏温度高，致肉质发生生理生化反应速度较快，在预实验基础上，每隔1 h取样监测直至样品腐烂。将29个监测点进行对比，选取样品风味具有明显变化的监测点，即0、12、14、16、17.5、20、21.5、23及26 h，用于牛肉常温货架指纹图谱构建。

样品B：模拟冷藏货架（8～10 ℃），将切割包装后的牛肉置于8～10 ℃冷藏货柜储藏，相对于样品A，肉质发生生理生化反应速度较缓，在预实验基础上，储藏前期每隔6 h取样监测，储藏130 h后每隔2 h取样，监测直至样品腐烂，将107个取样点进行对比，选取样品风味具有明显变化的监测点，即0、48、96、119、130、142、147、153、159、164及168 h，用于牛肉冷藏货架指纹图谱的构建。

样品C：模拟低温货架（0～1 ℃），将切割包装后的牛肉置于0～1 ℃低温冰箱储藏，由于温度接近冰点，肉质发生生理生化反应速度较慢，在预实验基础上，储藏前期每隔0.5 d取样，储藏19.5 d后每隔2 h取样，监测直至样品腐烂，将160个取样点进行对比，选取样品风味具有明显变化的监测点，即0、3、6、9、12.5、15.5、18.5、19.5、21、23.5、25、26.5、27、29.5 d，用于牛肉低温货架指纹图谱的构建。

试验时，将三种储藏条件下的鲜牛肉样品分别从塑料包装袋取出，搅碎成泥状后称取5.00 g置于20 mL顶空进样瓶中，备用。每份样本3个重复，用于GC-IMS分析。

1.2.2 GC-IMS测定条件 根据孟新涛等[20−21]的方法进行，稍有修改。将顶空进样瓶中的样品进行孵化，使用加热的进样针抽取瓶内的顶空组分，通过Flavour Spec气相离子迁移色谱仪分析挥发性组分。通过GC-IMS风味分析仪对不同储藏条件下牛肉中的挥发性化合物变化进行动态监测。孵化温度55 ℃；孵化时间20 min；孵化转速：500 r/min；进样量1 mL，不分流模式；清洗时间0.50 min；载气为高纯氮气（≥99.999%）；色谱柱温度45 ℃；进样针温度60 ℃；色谱运行时间21 min，设置程序流速2.00 mL/min并保持1 min，在10 min内线性增至20.00 mL/min，在5 min内线性增至100.00 mL/min，100.00 mL/min保持5 min。

2-戊酮（2-Pentanone）、2-己酮（2-Hexanone）、2-庚酮（2-heptanone）、2-辛酮（2-Octanone）、2-壬酮（2-nonanone）作为标准品确定样品中化合物的保留时间。

1.3 数据处理

采用设备自带的LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析软件，采用GC-IMS Library Search软件内置的2014NIST数据库和IMS数据库对特征风味物质进行定性分析、LAV中Reporter和Gallery插件程序构建挥发性有机物的差异图谱和指纹图谱；dynamic PCA plug-ins插件程序进行PCA处理。

2 结果与分析

2.1 不同储藏条件下鲜牛肉特征挥发性成分的3D差异动态分析

图1 是由LAV分析软件中Reporter插件程序制作的三种不同储藏方式下牛肉挥发性成分的3D对比图。对离子迁移时间和反应离子峰的位置进行了归一化处理。整个光谱代表了样品的所有顶空采集到的化合物。RIP右侧的每个点代表从样品中提取的挥发性化合物，颜色表示物质的信号强度。白色表示低强度，红色表示高强度。颜色越深，强度越大。图1A中，黑色圆圈内的部分特征挥发性成分在常温储存14 h出现，并在储存21.5 h达到高峰，具有较高的保留时间。图1B中，当8～10 ℃储存142 h时，黑色圈内部分特征物质消失，168 h时出现新的离子峰。图1C中，0～10 ℃储存19.5 d时，出现一些新的有机化合物，如黑色的圆圈所示。随着时间的延长，三种储藏方式下新的化合物出现的同时，部分化合物浓度增高，部分浓度降低至消失。这主要由于牛肉在不同储藏过程中发生复杂的脂肪酸、氨基酸及碳水化合物等生理生化代谢反应所致[22]。由此可见，随着储藏时间的延长，不同储藏条件下的牛肉样品中挥发性成分的含量及种类存在较大差异。

图1 牛肉样品在不同储藏条件下的三维地形图Fig.1 3D topographic plots of fresh beef under different storage conditions

2.2 不同储藏条件下鲜牛肉特征挥发性成分的2D差异动态分析

如图2所示，利用GC-IMS技术得到了不同储藏条件下鲜牛肉挥发性有机化合物的二维形态图，纵坐标表示保留时间，横坐标表示漂移时间，红色垂直线表示反应离子峰（reaction ion peak，RIP，归一化后漂移时间为7.22～7.41 ms），红色点代表反应离子峰，所有物质在漂移时间为1.0～1.8 ms，保留时间为100～1000 s，所有的有机挥发性物质在20 min内全部检出，但有些化合物不是由一个信号决定的，是单体、二聚体和三聚体在不同的漂移时间出现，这主要是因为离子（单体）在漂移时形成的，可能与分析物具有较高的质子亲和力或信号有关[23−24]。图2A选取0、14、21.5 h作为代表性谱图，从所有反应离子峰中选取具有代表性的28个信号，利用GC-IMS library seacher 1.0.3软件中2014NIST数据库和IMS数据库对特征风味物质进行定性分析，可识别出的信号包括6种醛、6种酮、5种醇、2种杂环、2种酯、1种胺类化合物（见表1）；图2B选取0、142、168 h作为代表性谱图，从所有反应离子峰中选取具有代表性的52个信号，可识别出的信号包括8种醛、6种酚、8种酯、1种呋喃、10种醇、1种酸、1种醚、7种酮和二恶烷（见表1）；图2C选取0、19.5、29.5 d作为代表性谱图，从反应离子峰中选取42个信号，可识别出的信号包括7种醛、5种酮、1种酸、6种醇、1种酯、2种杂环和二恶烷（见表1）。个别识别出但未被定性的化合物没有在表里列出。

表1 三种储藏方式下鲜牛肉特征风味物质定性分析信息Table 1 The information on identified compounds of fresh beef at three storage modes

图2 鲜牛肉样品在不同储藏时间的二维地形图Fig.2 2D topographic plots of fresh beef under different storage conditions

2.3 不同储藏条件下鲜牛肉特征挥发性物质指纹图谱的差异

将A、B、C三种储藏条件下鲜牛肉储藏过程中的所有离子峰汇总，利用GC-IMS LAV中Gallery插件程序构建挥发性有机物的指纹图谱，分析A、B、C在储藏期内挥发性有机物的动态变化情况。

续表 1

由图3A可知，鲜牛肉在25～30 ℃储藏过程中，0～14 h特征挥发物质变化较为缓慢，区域a中的2-丁酮（单体）、2-丁酮（二聚体）、二恶烷、2-戊酮（二聚体）、2-己酮3-甲基丁醇、环己酮、γ-丁内酯的含量在整个储藏期内无明显变化，储藏至14 h时，GCIMS图谱峰变多，区域b中丁酸丁酯、己醛（单体）、1-辛烯-3-醇、N-亚硝基二甲胺4种物质被检出，16 h时，区域c中2-甲基丙醇、乙醇、正丁醛、乙酸乙酯4种物质被检出，含量持续上升，21 h时，区域d中乙酸乙酯（二聚体）、丁酸、羟基丙酮3种物质被检出，且相对含量较高。可以看出，25～30 ℃条件下，牛肉的特征化合物在储藏过程中发生复杂的变化，尤其是储藏14 h后出现的醛、酮、醇、酸、酯及胺类等新的小分子特征挥发性有机物，可能由于脂肪氧化产生的糖代谢、氨基酸代谢及美拉德反应所致，随着浓度的不断增大，最终导致酸败味或有毒物质（N-亚硝基二甲胺）的产生[22−24]。

图3 不同储藏条件下鲜牛肉的特征风味指纹图谱Fig.3 The gallery plots of aroma compounds in fresh beef under different storage conditions

从图3B可以看出，鲜牛肉在8～10 ℃条件下储藏时，区域a中壬醛（单体）、壬醛（二聚体）、2-甲氧基苯酚、乙酸己酯、顺-乙酸-3-己烯酯、2-正戊基呋喃、苯甲醛（单体）、苯甲醛（二聚体）、5-甲基-2-呋喃、甲醇（单体）、5-甲基-2-呋喃甲醇（二聚体）、庚醛（单体）、丁酸丙酯、正戊酸、己醛（单体）、2,3-丁二醇戊醛、2,3-戊二酮、乙二醇二甲醚等16种挥发性物质仅在牛肉宰杀排酸后新鲜状态下被检出，储藏至48 h后消失；储藏至119 h，牛肉中的2-甲基丁酸甲酯、乙酸乙酯、2-甲基丙醇、正丁醛、2-乙基-1-己醇、己醛（二聚体）、异丙醇、戊醇、2-戊酮（单体）、正己醇（二聚体）、1-辛烯-3-醇、丁酸丁酯、2-丁酮（单体）、2-戊酮（二聚体）、丙醇、2-丁酮（二聚体）、2-己酮等15种挥发性物质变化较小，相对含量较为稳定；储藏至142 h时，区域b中异丁醇、乙酸乙酯（单体）、正己醇、2-庚酮等8种有机挥发性物质被检出，且随储藏时间的延长，相对含量不断增加，变化规律性较强[25−26]。挥发性物质出现变化可能与屠宰后的牛肉脂肪组织代谢活动有关，随着储藏时间的延长，代谢活动逐渐衰减，直至部分脂类化合物逐渐消失[27−29]；也可能与牛肉储藏过程中部分化合物作为反应底物参与美拉德反应有关[30−32]。此实验结果与傅忙娟等[29]利用GS-MS技术判断冷藏猪肉和羊肉的新鲜度所选用的乙酸乙酯、正己醇等特征挥发性有机物较为一致，但预判时间存在一定的差异，这可能由于检测对象、检测方法及储藏条件不同所致。

由图3C可以看出，鲜牛肉在在0～1 ℃低温环境储藏过程中，挥发性化合物整体变化不大，相对含量也基本保持稳定，己醛（单体）、壬醛、二恶烷、2-戊酮（单体）、2-乙基呋喃、2-丁酮、乙酸（单体）、丙酮、3-甲硫基丙醛、戊醇（单体）、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-甲基丁醛、乙酸（二聚体）、正己醇（单体）、正己醇（二聚体）、3-甲基丁醇、庚醛、正丁醛、戊醇（二聚体）、辛醛、2-庚酮（单体）等28种物质存在于整个储藏期内。当鲜牛肉储藏至19.5 d时，区域a中2-庚酮（二聚体）2-戊酮（二聚体）、异丙醇、乳酸乙酯、异丁醇、甲硫醇、六甲基环三硅氧烷、己醛（二聚体）等10种物质被检测出，且浓度随冷藏时间的延长不断增加，甲硫醇、六甲基环三硅氧烷具有难闻刺激性气味，对鲜牛肉货架期劣变产生较大的影响。相比常温25～30 ℃和冷藏8～10 ℃条件下，挥发性成分在全过程中含量变化不明显，且难找出规律。离子信号峰难找出规律，可能是因为冰鲜试验储存时间太长，长期低温储藏会抑制酶的活性，如脂氧合酶和醇酰转移酶，它们是酯芳香代谢的关键酶，会导致风味物质减少[19]。

2.4 基于主成分分析的特征分析

依据图3（A、B、C）构建的三种储藏方式下鲜牛肉特征风味物质动态变化的离子迁移色谱指纹图谱，采用dynamic PCA plug-ins插件程序进行PCA处理，观察同一储藏方式下鲜牛肉特征风味动态变化特征。由图4A可以看出，主成分1和主成分2的贡献率之和达到了64%，鲜牛肉在25～30 ℃储藏条件下，各样品组间和组内样品间特征风味具有一定的差异，0～14 h、16～20 h、21～26 h储藏的鲜牛肉样品分别相对集中于一定的范围内，但各组之间具有明显的间距，表明不同储藏时间的样品特征风味物质特异性较明显。由图4B可以看出，主成分1和主成分2的贡献率之和达到了69%，鲜牛肉在8～10 ℃储藏条件下，0～142 h鲜牛肉样品间特征风味差异不明显，但储藏时间相同的样品重复性较好，147～168 h样品相对集中于一定范围内，与0～142 h的样品具有明显的差异，样品间的聚集度较高，表明8～10 ℃储藏142 h可能为鲜牛肉风味物质变化的特征拐点。由图4C可以看出，主成分1和主成分2的贡献率之和达到了74%，鲜牛肉在0～4 ℃储藏条件下，0～19.5 d鲜牛肉不同储藏时间样品相对集中于一定的范围内，21～29.5 d不同储藏时间样品分布较为分散，但同一储藏时间样品间的聚集度较高，表明样品间的重复性好。

图4 不同储藏方式下鲜牛肉特征风味气相离子迁移色谱指纹图谱PCA分析结果Fig.4 PCA results for classification analysis of characteristic flavor of Fresh beef under different storage conditions

3 结论

本文采用GC-IMS技术，分析了排酸后的鲜牛肉在常温货架（25～30 ℃）、冷藏货架（8～10 ℃）和低温货架（0～1 ℃）三种不同货架储藏流通条件下特征风味物质动态变化规律，构建了不同条件下鲜牛肉的特征风味指纹图谱。25～30 ℃条件下储藏14 h，丁酸丁酯、2-己酮、1-辛烯-3-醇、丁酸丙酯（单体）4种物质可被检出，为其货架期风味变化的特征标记物质；8～10 ℃条件下储藏142 h，异丁醇、乙酸乙酯（单体）、正己醇、2-庚酮等8种有机挥发性物质被检出，为其货架期风味变化的特征标记物质；0～1 ℃条件储藏19.5 d，2-庚酮（二聚体）2-戊酮（二聚体）、异丙醇、乳酸乙酯、异丁醇、甲硫醇、六甲基环三硅氧烷、己醛（二聚体）等10种挥发性有机物质被检测出，为其货架期风味变化的特征标记物质。该结果与侯宝申[33]、关文强等[34]等采用传统微生物、色泽、挥发性盐基氮及理化指标综合评价的方法研究确定鲜牛肉常温和冰鲜保鲜期时限较为接近。表明，采用GCIMS快速检测技术预判鲜牛肉不同条件下的储藏时限具有一定的可行性。本文为生产中鲜牛肉的流通销售、安全食用和生产监管提供理论依据和数据支持。