青脆李益生菌饮品的发酵工艺优化及冷藏对其品质的影响
2021-08-11高伦江曾小峰曾顺德尹旭敏陈一龙
商 桑,高伦江,曾小峰,曾顺德,刁 源,尹旭敏,陈一龙
(重庆市农业科学院农产品加工研究所,重庆 401329)
李子已成为重庆第2大主栽水果,栽培面积达100万亩以上,产量超50万吨,重庆李子栽培品种主要为青脆李、脆红李等,已成为重庆巫山、酉阳、万州等地精准扶贫、乡村振兴的重要支柱产业。特别是“巫山脆李”已成为著名的区域公共品牌,品牌价值超20亿。青脆李皮薄肉脆、味甜汁多,营养丰富,富含多种维生素、氨基酸及矿物质,深受人们喜爱[1−3]。但青脆李是典型的呼吸跃变型果实,且重庆地区青脆李成熟期正值7~8月盛夏,由于环境温度较高,采后极易发生后熟现象,在常温运输中2~3 d便会发生软化、褐变以及腐烂等品质劣变现象[1],迫切需要保鲜和精深加工来支撑产业发展。
目前,以李子为原料的产品开发主要集中在果汁[4−5]、果酒[6−7]、果醋[8]、果脯[9]、蜜饯[10]、果干[11−12]及果糕[13]等,而有关青脆李益生菌饮品开发方面鲜有报道。许多传统发酵食品或地域特色食品,如泡菜、酸乳、奶酪、奶酒等,都有益生菌的存在[14]。随着人类对益生菌及其发酵产物与健康关系认识的不断深入,益生菌发酵食品受到了越来越多的关注。益生菌可改善人体肠道菌群平衡、改善乳糖不耐症、提高机体免疫力、合成营养素、预防食物过敏、降低血脂和保护肝脏、提高人体健康水平等[15−18]。乳制品是益生菌应用最多、最为成熟的食品领域,但乳制品中含有较高的脂肪和胆固醇,且还存在乳蛋白过敏、乳糖不耐受等健康风险,限制了益生菌发酵乳制品的消费[19]。基于果品的非乳益生菌发酵食品的开发受到越来越多的关注[20−21],水果富含糖类、有机酸、维生素、多酚、矿物质等多种营养成分和生物活性物质,是益生菌发酵的理想基质。研究发现,许多常见水果原料如苹果[22]、桑葚[23−24]、石榴[25]、猕猴桃[26]、樱桃[27]、柠檬[28]、橙[29]等益生菌发酵产品,其葡萄糖、果糖浓度下降,乳酸等有机酸含量增加,酯类、酮类和醇类等挥发性风味物质增加,抑菌活性、抗氧化能力及抗敏活性提高,不仅增加了益生功效,而且增进了产品的风味,且极大丰富了我国饮料和果蔬制品的种类。研发青脆李益生菌饮品,对提升青脆李精深加工产品档次具有重要意义。筛选青脆李益生菌饮品适宜发酵菌种、适宜的发酵工艺参数及冷藏品质变化规律,可为青脆李益生菌饮品生产提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
青脆李原料 产自重庆酉阳;益生菌嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,1.1854)、植物乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,1.2469)、嗜热链球菌(Lactobacillus acidophilus,1.2471)选购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC);MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基 奥博星生物技术有限公司。
SA-1600-2JZ多功能超净工作台 上海稼丰园艺用品有限公司;DJ2-4.0双道打浆机 江苏靖江食品机械制造有限公司;TG-1850医用离心机 四川蜀科仪器有限公司;BSP-250生化培养箱 上海博讯实业有限公司;PAL-1数显糖度计 日本Atago爱拓;无菌塑料一次性培养皿(90 mm)。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化 斜面冷藏保存的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌分别用接种针各取一环,分别接种于100 mL MRS肉汤培养基,37 ℃恒温培养48 h,获得发酵用菌种,3000 r/min离心15 min去上清液、无菌水洗涤、二次离心,再去上清液备用。
1.2.2 青脆李原浆制备 将青脆李洗净、晾干后采用双道打浆机破碎取汁盛放于不锈钢发酵桶内备用。
1.2.3 青脆李益生菌饮品适宜菌株筛选
1.2.3.1 青脆李益生菌饮品优势发酵菌株筛选 扩大活化后的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌+嗜热链球菌(1:1:1)分别以0.5‰质量比接种量接种于青脆李原浆中,37 ℃下连续培养3 d,每隔8 h定时测定青脆李益生菌饮品的pH变化情况。
1.2.3.2 混合菌株不同接种比例对生长速度的影响 优选后的混合菌株按照1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、2:1:1、2:2:1比例混合,按0.5‰质量比接种量接种于青脆李原浆中,37 ℃下培养3 d,定时测定其活菌落总数。
1.2.4 青脆李益生菌饮品发酵工艺研究单因素优化
1.2.4.1 菌株添加量对青脆李益生菌饮品感官评分的影响 以感官评分作为考察青脆李益生菌饮品发酵品质的特征指标。37 ℃,发酵3 d条件下,发酵接种量0.1‰、0.3‰、0.5‰、0.7‰、0.9‰、1.1‰(质量比)为单因素实验,确定菌株添加量最佳水平范围。
1.2.4.2 发酵温度对青脆李益生菌饮品感官评分的影响 以感官评分作为考察青脆李益生菌饮品发酵品质的特征指标。0.5‰接种量,发酵3 d条件下,发酵温度20、25、30、35、40 ℃为单因素实验,确定发酵温度最佳水平范围。
1.2.4.3 不同发酵时间对青脆李益生菌饮品感官评分的影响 以感官评分作为考察青脆李益生菌饮品发酵品质的特征指标。0.5‰接种量下,25 ℃条件下,发酵时间24、32、40、48、56、64、72 h为单因素实验,确定发酵时间最佳水平范围。
1.2.5 青脆李益生菌饮品发酵工艺优化正交试验在单因素实验的基础上,确定各因素的最佳水平范围,以发酵温度(A)、发酵时间(B)、接种量(C)及空白(D)为自变量进行正交试验,以感官评分为指标,设计正交因素水平设计表见表1。
表1 正交实验L9(34)因素水平设计表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment
1.2.6 冷藏对青脆李益生菌饮品贮藏品质的影响在4 ℃冷藏条件,分别于5、10、15、20、25、30 d定期测定可滴定酸、pH、可溶性固形物、还原糖及活菌落总数,考察冷藏时间对青脆李益生菌饮品贮藏品质影响情况。
1.2.7 指标测定
1.2.7.1 活菌落总数 稀释涂布法测定活菌群总数[30]:无菌条件下取25 mL青脆李益生菌饮品,加入225 mL无菌生理盐水中,振摇,制成10−1的均匀稀释液,再取1 mL稀释液加入9 mL无菌生理盐水中,制成10−2稀释液,并继续进行梯度稀释至10−8。在进行梯度稀释的同时,分别吸取该稀释度的稀释液1 mL于两个无菌培养皿内,倒入47 ℃左右的MRS琼脂培养基并混匀,待培养基凝固后,于37 ℃恒温倒置培养48 h,选择菌落总数在30~300个的平板进行计数。
1.2.7.2 总酸含量 采用酸碱滴定法测定(GB/T 12456-2008 食品中总酸的测定)。
1.2.7.3 pH 采用pH计测定。
1.2.7.4 可溶性固形物含量 采用手持糖度计测定。
1.2.7.5 还原糖含量 采用直接滴定法测定(GB5009.7-2016食品中还原糖的测定)。
1.2.7.6 青脆李益生菌汁感官评价 选取长期喜食益生菌酸奶及益生菌发酵果汁且年龄25-30岁,男女各半的嗜好型评定人员组成评定小组,从青脆李益生菌饮品色泽、气味、口感等方面综合进行评定,满分为10分,取平均分进行评定[31],感官评价标准见表2。
表2 青脆李益生菌饮品感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria for fermented Prunus americana juice
1.3 数据处理
实验数据采用Excel 2010软件处理,实验数据以平均值±标准偏差(±s)形式表示。
2 结果与分析
2.1 青脆李益生菌饮品适宜菌株筛选
2.1.1 青脆李益生菌饮品优势发酵菌株筛选 图1结果表明,各发酵菌株组合发酵青脆李原浆,其pH值随着发酵时间的延长,前期下降较快、后期下降较慢。72 h下嗜酸乳杆菌发酵青脆李原浆其pH下降32.54%、植物乳杆菌下降29.19%、嗜热链球菌下降28.60%、三菌株混合发酵下降35.31%。从菌株对益生菌饮品pH值影响考虑,认为植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌+嗜热链球菌为优势发酵菌株组合。
图1 不同益生菌对青脆李益生菌饮品pH的影响Fig.1 The influence of different probiotics on the pH value of fermented Prunus americana juice
表3 感官评分结果显示,植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌+嗜热链球菌优于其他三种益生菌株单独使用。综合图1和表3结果认为植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌+嗜热链球菌可作为优势菌株进一步开展发酵工艺及参数优化。
表3 不同益生菌对青脆李益生菌饮品的感官评价Table 3 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana juice with different probiotics bacterias
2.1.2 混合菌株不同接种比例对生长速度的影响图2结果表明,不同混合菌株比例其菌落总数随发酵时间延长初期呈上升趋势,后期呈缓慢增长趋势。菌落总数最高可达3.48×109,最低也有2.97×109,均达到109数量级,与猕猴桃[26]益生菌发酵汁菌落总数相当,超过乳酸菌饮料[32]106CFU/mL标准。总体看来对菌落总数影响均不明显。本着方便原则,选择植物乳杆菌:嗜热链球菌:嗜酸乳杆菌=1:1:1开展后续工作。
图2 接种比例对菌株生长速率的影响Fig.2 The change of inoculation ratio on the growth rate of strainsn
2.1.3 青脆李益生菌饮品发酵工艺研究单因素优化
2.1.3.1 菌株添加量对青脆李益生菌饮品感官评分的影响 接种量较低和较高时,对发酵感官均影响较大。接种量过低,发酵时间较长,发酵速度较慢,风味物质形成较少,产酸量低且容易受到杂菌污染;接种量过高,较难控制发酵速度,发酵产品容易偏酸,且发酵风味过于浓郁,发酵速度虽能加快但微生物细胞易衰老,且出现自溶现象[33]。图3结果表明,随着接种量的增加,感官评分逐渐上升,然后呈下降趋势,接种量0.3‰时感官评分为8.2、0.5‰时8.7,0.7‰时8.9,感官评分高低反应益生菌饮料色泽、气味和口感的优劣,综合考虑确定最适菌株添加量范围0.5‰~0.7‰。
图3 接种量对青脆李益生菌饮品感官评价的影响Fig.3 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different inoculation
2.1.3.2 发酵温度对青脆李益生菌饮品感官评分的影响 发酵温度影响代谢产物的产量和质量,以及产品的酸度和风味[34]。图4结果表明,发酵温度过低,代谢不活跃,产酸不足,使酸甜不协调;发酵温度越高代谢越旺盛,产酸越快,但过高,导致口感过酸而不愉悦[35];随着发酵温度的上升,感官评分由上升趋势转为下降趋势。发酵温度20 ℃时感官评分为8.1、25 ℃时8.4,30 ℃时8.3,感官评分高低反应益生菌饮料色泽、气味和口感的优劣,综合考虑确定最佳发酵温度范围20~30 ℃。
图4 发酵温度对青脆李益生菌饮品感官评价的影响Fig.4 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different temperature
2.1.3.3 不同发酵时间对青脆李益生菌饮品感官评分的影响 发酵时间与发酵食品的风味品质密切相关,发酵时间过短,则发酵菌株还处于自身生长阶段,代谢物质较少;发酵时间过长,则造成代谢物质积累产生异味[36]。图5结果表明,随着发酵时间的延长,青脆李益生菌饮品感官评分呈先上升后下降趋势。发酵时间32 h感官评分为8.3、40 h时8.6,48 h时8.9,感官评分高低反应益生菌饮料色泽、气味和口感的优劣,综合考虑最佳发酵时间范围40~48 h。
图5 发酵时间对青脆李益生菌汁感官评价的影响Fig.5 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different time
2.2 青脆李益生菌饮品发酵工艺优化正交试验
由表4可知,正交试验结果R值可以看出,各因素对青脆李益生菌饮品感官的影响顺序为A(温度)<B(时间)<C(接种量)。从各因素K值可以看出,温度、时间、接种量3因素试验最佳组合为A2B2C3,即发酵温度25 ℃、发酵时间44 h,接种量0.7‰。采取A2B2C3验证试验检测发现青脆李益生菌饮品感官评价分值达到9.2,证实此组合为较优的试验方案。
表4 L9(34)正交试验设计及结果Table 4 L9(34)Orthogonal test design and results
2.3 冷藏对青脆李益生菌饮品贮藏品质的影响
2.3.1 冷藏对青脆李益生菌饮品可滴定酸、pH变化的影响 图6结果表明,4 ℃冷藏条件下总酸含量缓慢增加,pH值趋于平稳。这是因为贮藏过程益生菌菌株处于衰亡期,随着代谢产物积累和生长环境的恶劣,产酸速度则趋于变缓,pH值也相对稳定。
图6 4 ℃冷藏对青脆李益生菌饮品总酸、pH影响Fig.6 The change of acid and pH in the condition of 4 ℃ refrigeration
2.3.2 冷藏对青脆李益生菌饮品可溶性固形物、还原糖含量的影响 图7结果表明,4 ℃冷藏条件青脆李益生菌饮品可溶性固形物含量随冷藏时间的推移缓慢下降,但总体上变化不大。可能原因是青脆李原浆中含有的大量原果胶在酸性条件下水解为果胶,水溶性果胶的增加弥补了益生菌发酵过程消耗的葡萄糖和果糖,造成可溶性固形物的变化不明显。由于青脆李益生菌饮品中还原糖的水解和消耗的速度达到了一个平衡,所以还原糖含量相对稳定。
图7 4 ℃冷藏对青脆李益生菌饮品还原糖、可溶性固形物影响Fig.7 The change of reducing sugar and soluble solids in the condition of 4 ℃ refrigeration
2.3.3 冷藏对青脆李益生菌饮品活菌落总数的影响图8结果表明,青脆李益生菌饮品4 ℃冷藏条件活菌落总数随储存时间的延长逐渐降低,冷藏20 d活菌落总数为8.6×107CFU·mL−1,满足活性乳酸菌饮品要求[37]。冷藏30 d活菌数仍有2.0×106CFU·mL−1,与国家标准GB19302[38]规定发酵乳的乳酸菌数应不少于1×106CFU·mL−1相当。
图8 4 ℃冷藏对青脆李益生菌饮品活菌数的影响Fig.8 The number of viable bacteria in the condition of 4 ℃ refrigeration
3 结论与讨论
益生菌菌株是影响果汁发酵的关键因素,不同益生菌菌株对果汁理化特性和营养组成的适应能力不同,其在果汁中的生长与发酵性能也存在较大差异,对猕猴桃[26]、苹果[39]发酵的风味以及营养成分的影响也不相同。本研究通过初筛发现嗜酸乳杆菌1.1854、植物乳杆菌1.2469、嗜热链球菌1.2471及三菌株组合发酵能显著降低青脆李原浆pH值,三菌株组合发酵活菌落总数、感官评分占优,最优工艺条件植物乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌1:1:1混合菌株接种量0.7‰、发酵温度25 ℃、发酵时间44 h下,获得青脆李益生菌饮品感官评分9.1(满分10分);说明所筛选的复合益生菌菌株适合青脆李原浆发酵,可用于青脆李益生菌饮品的开发。活菌数是益生菌发酵食品的一个重要指标,成为菌株筛选与工艺优化的首选考察指标。但活菌数测定程序复杂、耗时长,考虑用简单、快速的指标替代。常采用可滴定酸含量、pH反映乳酸菌在果汁中的生长与发酵情况[40]。本研究初筛主要考察发酵青脆李益生菌饮品pH值和感官评分,目的在于快速筛选对青脆李原浆发酵能力强、有利于保持或提高青脆李营养功能的益生菌菌株。
除菌株对果汁的适应性和发酵能力外,菌株对发酵风味的影响也至关重要,感官评分常作为菌株筛选与工艺优化的考察指标[41]。本研究以感官评分为指标进行菌株复筛和和发酵青脆李原浆工艺优化,获得了发酵青脆李益生菌饮品适宜菌株组合以及最佳发酵工艺条件。
益生菌发酵果汁活菌落数在贮存过程中的变化与贮藏温度密切相关,本研究表明,4 ℃冷藏条件下存放20 d活菌数仍在8.6×107CFU·mL−1,30 d达2.0×106CFU·mL−1,与国家标准规定发酵乳的乳酸菌数应不少于1×106CFU·mL−1相当,说明低温贮存有利于活菌数的保持,青脆李益生菌饮品采用低温保藏和冷链流通;在4 ℃冷藏条件下其可滴定酸、pH值、可溶性固形物含量、还原糖含量均基本保持稳定,相关品质指标是否与贮藏温度有关,还有待进一步探索。