特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-氯丙醇酯及缩水甘油酯的测定

赵丽敏，黄云霞，孟志娟，牛立沙，张亚丽，王 藤，邸鹏月，张冬生，孙文毅

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050200）

氯丙醇脂肪酸酯是近几年食品安全检测的重要关注对象，其中3-氯丙醇酯（3-chloropropanol esters，3-MCPDE）的污染情况和检出率尤为突出[1]。当3-MCPDE被摄入体内会分解为3-氯-1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD），3-MCPD具有致癌、遗传毒性等危害[2-3]。缩水甘油酯（glycidol esters，GE）是缩水甘油和游离脂肪酸的酯化产物，主要存在于棕榈油及婴儿配方乳粉等食品中。GE的代谢产物缩水甘油具有基因危害[4]。3-MCPD和GE分别被国际癌症组织归为2B级和2A级致癌物[5-6]。

3-MCPDE污染主要来自食用植物油，其中棕榈油含量相对较高，由于棕榈油等精炼植物油在婴幼儿配方乳粉中的广泛使用，导致婴幼儿配方乳粉和特殊医学用途婴儿食品也存在一定程度的3-MCPDE和GE污染[7-9]。特殊医学用途婴儿配方食品指针对1 岁以下患有特殊紊乱、疾病或医疗状况等特殊医学状况婴儿的营养需求而设计制成的粉状或液态配方食品。

欧盟委员会（EU）2018/290法规修订欧盟委员会实施条例（EU）No 1881/2006，规定从2019年7月1日起，婴幼儿配方乳粉、较大婴儿配方乳粉和婴幼儿特殊医用食品（粉状）中GE的最高限量从75 μg/kg改为50 μg/kg。2021年，国家食品安全抽检新增了婴幼儿特殊医学用途食品（粉状）和食用油中GE的检测。特殊医学用途婴幼儿配方食品是非母乳喂养婴儿的主要营养素摄入来源，因此建立特殊医学用途婴幼儿配方食品（粉状）中3-MCPDE和GE的检测方法对于开展风险评估及标准制定具有重要意义。

目前有关特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE同时测定的间接检测方法较少，本研究以特殊医学用途婴幼儿配方食品为研究对象，建立一种同时测定3-MCPDE和GE含量的间接检测法，针对样品提取、酯交换水解2 个样品前处理条件进行优化，结合同位素稀释技术，提高检测方法的准确度和精密度，为特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE检测方法的完善、相关标准的制定及限量提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3 种特殊医学用途婴幼儿配方食品，分别为乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方和乳蛋白部分水解配方。

甲醇、丙酮、冰乙酸、乙酸乙酯、正己烷、异辛烷、叔丁基甲醚（均为色谱纯） 美国Supelco公司；甲醇钠（分析纯） 上海麦克林生化试剂有限公司；无水硫酸钠（分析纯） 天津市光复科技发展有限公司；氯化钠（分析纯） 天津大茂化学试剂公司；苯基硼酸（phenylboronic acid，PBA）（分析纯） 美国Alfa Aesar公司；3-MCPD棕榈酸双酯、棕榈酸GE（质量浓度1 000 μg/mL）、d5-3-MCPD棕榈酸单酯（纯度均大于98%） 加拿大多伦多TRC公司。

1.2 仪器与设备

TQ8040气相色谱-串联质谱仪、Rtx-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 日本岛津公司；3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；N-EVAP-24氮吹仪美国Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取适量3-MCPD棕榈酸双酯和d5-3-MCPD棕榈酸单酯标准物质（精确到0.001 g），用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成质量浓度分别为1 000 μg/mL和100 μg/mL的标准储备溶液。

分别准确吸取5.314 mL 3-MCPD棕榈酸双酯和2.827 mL GE标准储备液于100 mL容量瓶中，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）定容至刻度，分别配制成质量浓度为10.0 μg/mL（均以对应的氯丙醇计）的标准储备溶液，4 ℃贮存。

准确吸取3.202 mL d5-3-MCPDE于10 mL容量瓶中，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）定容至刻度，配制成质量浓度为10.0 μg/mL的内标溶液（以对应的氯丙醇计），于4 ℃贮存。

用适量的叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）将各标准储备液稀释（每个标准品需要2 份，作为A、B组）配制成质量浓度分别为0.005、0.050、0.200、0.500、1.000、2.000 μg/mL的混合系列标准工作液，其中内标质量浓度为1.00 μg/mL。

1.3.2 样品前处理

称取2.0 g样品于50 mL离心管中（每个样品需制备A、B对照组），加入2 mL 65 ℃温水混匀，加入50 μL d5-3-MCPDE标准工作液；混匀后加入5 mL叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液（8∶2，V/V），超声20 min，9 500 r/min离心5 min，收集上清液；重复提取2 次并将上清液转移至15 mL离心管中，45 ℃氮吹至体积约为2 mL；加入0.5 mL 0.5 mol/L甲醇钠-甲醇溶液，混匀并反应5 min后，向A、B组分别加入3 mL含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL NaCl溶液、3 mL含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液，终止水解反应；充分涡旋后再加入3 mL正己烷进行脱脂，待分层后，弃去上清液，重复脱脂2 次；待测液中加入200 µL PBA，充分振荡；70 ℃衍生20 min后，加入5 mL乙酸乙酯提取2 次；45 ℃下氮吹至干，用1 mL异辛烷复溶，过有机膜，待分析。

将系列标准混合工作液与2 mL乳粉上清液同时进行水解、衍生化反应。

1.3.3 实验条件

色谱条件：载气：高纯氦气（纯度99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度280 ℃；升温程序：85 ℃保持1 min，以6 ℃/min速率升温至150 ℃，再以12 ℃/min速率升温至180 ℃，最后以25 ℃/min升温至290 ℃，保持7 min；进样方式：不分流进样；进样量1 μL。

质谱条件：电离源：电子轰击离子源；电离电压70 eV；离子源温度280 ℃；传输线温度280 ℃；碰撞气：高纯氦气（纯度99.999%）；溶剂延迟时间4 min；采用选择离子扫描方式。

3-MCPD衍生化合物质谱测定条件：m/z196、147*、91、146；d5-3-MCPD衍生化合物质谱测定条件：m/z201*、150、93、149。其中带*的为定量离子。

1.4 数据处理

采用TQ8040气相色谱-串联质谱仪GCMSsolution Version 4.30软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

样品提取是准确检测特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE的前提。本研究对比正己烷[9-10]和叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液（8∶2，V/V）[11-12]2 种提取溶剂的提取效果，分别考察3-MCPDE的回收率和提取溶液的状态。

由表1可知，正己烷提取效果较差，3-MCPDE回收率仅34.1%，且正己烷与样品经超声之后乳化严重，尤其是乳蛋白部分水解配方样品乳化严重，提取上清液仅5 mL。叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液提取后样品均匀，乳化不明显，3-MCPDE回收率可达98.6%，因此，选择叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液为提取溶剂。

表1 提取溶剂对3-MCPDE的提取效果Table 1 Extraction efficiencies of 3-MCPDE with different solvents

2.2 酯水解条件的优化

氯丙醇酯的酯交换水解反应液主要采用甲醇钠-甲醇溶液[13-15]和硫酸甲醇溶液[16-17]。Miyazaki等[18]研究发现，在含有氯离子的酸性溶液中，GE易转化成3-MCPD，引起定量结果偏高。所以本研究用甲醇钠-甲醇溶液作为碱水解液，并对碱水解溶液的水解时间进行优化。以3-MCPDE的回收率为指标，考察0.5、1.0 mol/L甲醇钠-甲醇溶液分别在水解1、3、5、7、9 min时的回收率。

由图1可知，采用1.0 mol/L甲醇钠-甲醇溶液时，水解液不够均匀，有微量沉淀，并且因溶液碱性较强，反应迅速，须严格控制反应时间。0.5 mol/L甲醇钠-甲醇作为碱水解液，随水解反应时间延长，回收率增加，水解7 min时回收率最高。胡守江[19]、黄翠莉[20]等研究发现，在碱性环境中，碱水解反应时间过长会造成氯丙醇的降解，因此在保障碱水解反应充分的前提下，应尽量缩短碱水解反应时间[21]。本研究选用甲醇钠-甲醇溶液浓度为0.5 mol/L，水解时间为7 min，不仅水解效率高，而且适合日常检验中多批次样品的同时处理。

图1 甲醇钠-甲醇溶液浓度和水解时间对3-MCPDE回收率的影响Fig. 1 Influence of hydrolysis time on recovery of 3-MCPDE with sodium methoxide methanol solution of different concentrations as hydrolysate

2.3 水解终止液的选择

酯交换水解过程中，氯离子存在时GE会转化成3-MCPD[18]，不含氯离子时，GE无法转化为3-MCPD。每个样品做A、B组，A组在水解反应终点添加含氯的终止反应液（含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL NaCl溶液），B组在水解反应终点添加不含氯的终止反应液（含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液），衍生化由A组测得3-MCPDE与GE的总量，由B组测得3-MCPDE的实际含量，利用差减法得到GE含量。

针对B组终止液，通过空白样品添加了3-MCPDE，比较2 种不含氯的水解终止液（含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液和含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL NaCl溶液）的效果，结果表明，使用含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液时3-MCPD回收率较高，因此选择含体积分数4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液作为水解终止液。

2.4 衍生化试剂的选择

常用的衍生化试剂有N-七氟丁酰基咪唑（N-heptafluorobutyrylimidazole，HFBI）[22]、PBA、七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）、三氟乙酸酐（trifluoroacetic anhydride，TFAA）等。HFBI性质活泼，容易挥发结块，且容易与水反应，衍生过程中必须保证充分干燥[23]；HFBA和TFAA性质活泼，容易衍生，但是副产物复杂，影响定量结果[24]。相比之下，PBA性质较稳定，可在水溶液中进行，衍生后的化合物电负性显著增强，检测灵敏度较高。因此选用PBA作为衍生化试剂。

2.5 方法的检出限、定量限和线性范围

在优化的实验条件下，系列混合标准工作液与样品同时进行水解、衍生化等前处理，线性范围为0.005～2.000 μg/mL，A、B对照组标准曲线分别为y=0.868 1x＋8.154 7×10－2（R2=0.999 4）、y=0.770 6x＋0.276 9（R2=0.999 2），线性良好，相关系数（R2）均大于0.999 0。以3 倍信噪比考察方法的检出限，得到检出限为5 μg/kg，10 倍信噪比考察方法的定量限，得到定量限为25 μg/kg。

2.6 方法的精密度和回收率

以3 种常见的特殊医学用途婴幼儿配方食品：乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方和乳蛋白部分水解配方为基质，分别添加混合标准溶液，使加标水平分别为25、125、250 μg/kg，考察方法的回收率，每个添加水平做6 个平行。

由表2可知，3 种特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE回收率为88.5%～104.1%，相对标准偏差低于15%。表明该方法精密度高，重复性好。

表2 3 种特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision of 3-MCPDE and GE spiked in three types of infant formula for special medical purposes (n = 6)

3 结 论

基于改进的样品前处理方法，结合气相色谱-串联质谱技术，建立特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE的间接检测方法。该方法操作简单、快速、成本低、结果准确，能满足日常特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE的检测，为特殊医学用途婴幼儿配方食品中3-MCPDE和GE限量标准的制定及风险评估提供了参考。