含乳特殊医学用途配方食品中沙门氏菌检测即用型质控样品研制

张 涛，张 瑞，张雅伦，许苗苗，王 慧，陈 晨，周 巍,2,*，史国华,*

（1.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050200；2.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050000）

含乳特殊医学用途配方食品是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为原料，经工业加工制备，满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食特殊需要的乳制品，为特殊人群强化骨骼[1]、改善神经发育和认知功能[2]、增强免疫力[3]等提供营养物质。然而，含乳特殊医学用途配方食品易被微生物污染，引起食物中毒，对人体健康造成严重危害，对社会造成不良影响[4]。在引起含乳特殊医学用途配方食品中毒的食源性致病菌中沙门氏菌占比较大。沙门氏菌可引起伤寒、副伤寒、胃肠炎、败血症和局部感染等疾病[5-6]。现已发生多起含乳特殊医学用途配方食品感染沙门氏菌引起的腹泻中毒事件。2019年2月，法国公共卫生部门宣布在婴幼儿米粉中检测到沙门氏菌，造成26 名婴幼儿中毒[7]。可见，沙门氏菌致病性强，是引起含乳特殊医学用途配方食品中毒的重要致病菌[8-9]。

由于监督不严、检验体系不科学，造成食品安全问题不断出现。目前，含乳特殊医学用途配方食品中沙门氏菌的检测方法主要有传统血清分型检验、聚合酶链式反应技术[10-12]、免疫学检测法[13]、近红外技术及纳米技术[14]。以上方法具有检测周期长、操作繁琐、结果判定误差大等诸多弊端。因此，建立快速、有效的含乳特殊医学用途配方食品中沙门氏菌检验方法具有重要意义。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年发展起来的用于病原微生物快速鉴定的一种方法[15-16]，可以实现对未知微生物的快速鉴定、分型、溯源等[17-19]。目前，MALDITOF-MS技术可以鉴定金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、宋内志贺菌、单增李斯特菌、大肠杆菌及厌氧菌，并取得较好的分析结果[20-24]。国内对基于MALDI-TOF-MS技术检验沙门氏菌阳性物质的研究较少，为更加便捷、快速检测出含乳特殊医学用途配方食品中沙门氏菌，本研究自制即用型沙门氏菌质控样品，验证该质控样品在含乳特殊医学用途配方食品中沙门氏菌检验中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙门氏菌标准菌株（CMCC 50959） 中国食品药品检定研究院。

无水乙醇、甲酸、乙腈（均为质谱纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；质谱样品处理基质 德国布鲁克科技有限公司；TSA培养基 北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

MALDI-TOF/TOF 7090质谱仪 日本岛津公司；MIR-254低温恒温培养箱 日本Sanyo公司；ME204电子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；3K15台式离心机德国Sigma公司；VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪法国生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 即用型沙门氏菌质控样品制备及检测

1.3.1.1 制备过程

在超纯水中加入蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白，质量浓度分别为15、8、5 g/100 mL，制得保护剂。将沙门氏菌标准菌株划线接种于PCA培养基，36 ℃培养24 h；用无菌棉签从平板上刮取菌苔放入生理盐水中，混悬于冻干保护剂中，测得菌悬液麦氏浊度为2.5 MCF；向每个含有干燥剂的西林瓶中加满液氮并滴加100 μL菌悬液，放入真空冷冻干燥机。待样品充分干燥后取出，密封压盖冷藏。

1.3.1.2 计数方法

取出未开启的冻干菌球瓶，放置至室温，用酒精棉球擦拭铝塑盖和胶塞并开启。将冻干菌球放入10 mL无菌水中，稀释，倾注适量TSA培养基，放置于36 ℃培养箱24 h，计数。

1.3.1.3 MALDI-TOF-MS检验

取出未开启的冻干菌球瓶，放置至室温，用酒精棉球擦拭铝塑盖和胶塞并开启；将菌球取出，放置于2 mL离心管，加入100 μL无菌水，振荡1 min，12 500 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀中加入100 μL无菌水，重复离心3 次；离心所得沉淀中加入50 μL体积分数70%甲酸，振荡2 min，再加入50 μL乙腈，振荡2 min，吸取1 μL上清液滴到靶板上，室温晾干后覆盖1 μL基质，晾干，放入质谱仪。

在质荷比（m/z）2 000～20 000 Da进行检测。根据MALDI-TOF-MS分析得出的特征性质谱图分析沙门氏菌裂解后特异性蛋白质或多肽离子峰，实现区分和鉴定的目的。

1.3.2 质控样品均匀性研究

随机抽取沙门氏菌冻干标准样品20 瓶，向每瓶标准样品中加入1 mL生理盐水，将冻干样品充分溶解，使用全自动微生物螺旋加样系统在E50模式下涂布于PCA平板，每个样品做2 个平行。置于（36±1） ℃培养24 h，对结果进行统计分析，评价样品的均匀性。

1.3.3 质控样品稳定性研究

运输条件模拟实验：将沙门氏菌质控样品分成2 份，其中一份放置于37 ℃培养箱，另一份放置于25 ℃培养箱，分别在贮藏0、1、3、5、7、14 d取出质控样品，按照1.3.1.2节步骤计数，并作3 次平行实验。

贮存条件模拟实验：将沙门氏菌质控样品分成2 份，其中一份放置于4 ℃冰箱，另一份放置于－20 ℃冰箱，分别在贮藏0、1、3、5、7、14、28 d取出质控样品，按照1.3.1.2节步骤计数，并作3 次平行实验。复苏率按下式计算。

1.3.4 沙门氏菌质控样品鉴定

将菌球放入25 g无菌乳粉中，按照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》进行后续培养，用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统鉴定。

1.4 数据处理

使用SSPS软件，采用单因素方差分析对20 瓶沙门氏菌质控样品均匀性检测结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 即用型沙门氏菌质控样品

本研究制得沙门氏菌质控样品为白色圆球状，西林瓶密封性良好，干燥剂未变色，水分去除完全，符合所需要求，可做为后续实验样品。

2.2 沙门氏菌质控样品均匀性检测结果

对20 瓶沙门氏菌质控样品进行检测。由表1可知，各样品菌落数相差极小，平行性良好，各样品间菌落数没有明显差异。

表1 20 瓶沙门氏菌标准物质稀释10 倍计数结果Table 1 Counting results of 20 bottles of Salmonella standard

均匀性FINV（0.05，19，20）临界值=2.137，由表2可知，根据SPSS软件计算所得结果，F=0.804＜FINV（0.05，19，20）临界值，表明在0.05显著水平，该样品符合均匀性的要求。

表2 沙门氏菌质控样品均匀性实验结果Table 2 Uniformity of Salmonella quality control samples

2.3 沙门氏菌质控样品稳定性检测结果

=3）Table 3 Stability of 10-fold diluted Salmonella quality control samples under simulated transport conditions (n = 3)表3 沙门氏菌质控样品稀释10 倍模拟运输条件实验结果（n

由表3可知，在37 ℃和25 ℃环境中，每个沙门氏菌质控样品菌数相差较小，14 d内能保持良好稳定性。所以高温环境可采用泡沫箱加冰袋运输，常温环境可直接运输。

=3）Table 4 Stability of 10-fold diluted Salmonella quality control samples under simulated storage conditions (n = 3)表4 沙门氏菌质控样品稀释10 倍模拟贮存条件实验结果（n

对沙门氏菌质控样品进行－20 ℃和4 ℃贮藏稳定性实验，实验为期28 d。由表4可知，－20 ℃环境下贮藏28 d复苏率为92.17%，沙门氏菌质控样品稳定性良好，根据以往对沙门氏菌质控样品的制备经验，在－20 ℃条件下可以保存长达18 个月；4 ℃环境下，贮藏28 d复苏率为90.43%，可以作为短期贮藏条件。

2.4 沙门氏菌质控样品MALDI-TOF-MS检测结果

验证质控样品低温、长时间保藏后的作用效果。测得于－20 ℃贮藏0、14、28 d质控样品的质谱图，由图1～3可知，比较3 次所得质谱图可知，离子峰出现位置基本相同，信号稳定。沙门氏菌质控样品变化极小，符合MALDI-TOF-MS质控样品要求。

图1 贮藏0 d沙门氏菌质控样品质谱图Fig. 1 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 0

图2 贮藏14 d沙门氏菌质控样品质谱图Fig. 2 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 14

图3 贮藏28 d沙门氏菌质控样品质谱图Fig. 3 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 28

2.5 沙门氏菌质控样品生化鉴定结果

由表5可知，VITEK2 Compact全自动微生物分析系统测定结果为沙门氏菌，可信度为99%，表明沙门氏菌质控样品未受污染，菌体未被破坏。

表5 沙门氏菌质控样品生化反应鉴定结果Table 5 Biochemical identification results of Salmonella quality control samples

3 结 论

MALDI-TOF-MS鉴定是近几年检测微生物的新方法，弥补了传统方法和基因型鉴定方法的不足，逐渐被各检测机构认可和应用[25]。通过比较标准菌株图谱得出结论，此方法操作便捷、结果直观[26-27]。

本研究制得沙门氏菌质控样品具有良好的均匀性，在模拟运输稳定性及贮存稳定性中菌数变化较小，满足日常运输条件并具有较长有效期。对－20 ℃贮藏0、14、28 d的沙门氏菌质控样品进行质谱检测，结果显示，质控样品鉴定质谱图相近，可作为日常实验对照。综上所述，MALDI-TOF-MS即用型质控样品可为检测含乳特殊医学用途配方食品中沙门氏菌提供持续、有效的检验依据。