特殊医学用途婴儿配方乳粉中左旋肉碱含量测定方法优化

马晓博，吴 磊，张 斌，张兰天，盖丽娜

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050200）

左旋肉碱又被称为维生素BT，是一种类维生素营养素，其作为营养强化剂广泛应用于婴幼儿食品、减肥类保健品、中老年人营养补充食品中[1-4]。左旋肉碱通过调节线粒体内酰基的比例，促进支链氨基酸正常代谢，在婴儿利用脂肪作为能量来源的代谢中起着重要作用，因此左旋肉碱是婴幼儿必需营养物质[5-7]。GB 25596—2010《食品安全国家标准 特殊医学用途婴儿配方食品通则》[8]和GB 29922—2013《食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则》[9]规定，左旋肉碱作为特殊医学用途配方食品的可选择性成分，其添加量≥0.3 mg/kJ。特殊医学用途婴儿配方食品作为婴幼儿早期甚至长期赖以生存的主要食物来源，其质量应得到严格控制[5]。

目前，左旋肉碱的检测方法主要有高效液相色谱法、质谱法、离子色谱法和分光光度法等[10-18]。GB 29989—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》[19]中的检测方法为分光光度法，该方法较其他方法具有操作简单的优点，是目前检测机构普遍采用的方法[19-20]。本研究在GB 29989—2013的基础上，针对特定基质配方的特殊医学用途婴儿配方乳粉，从标准曲线制作、样品前处理、乙酰肉碱转移酶配制等几个方面进行分析优化，研究其对左旋肉碱测定的影响，为特殊医学用途婴儿配方乳粉检测提供参考[21]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售婴幼儿配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解和部分水解配方特殊医学用途婴儿食品（3 类特殊医学用途乳粉配料均含有麦芽糊精），各10 批次。

α-淀粉酶（酶活力≥3.7 U/mg） 北京奥博星生物技术有限责任公司；乙二胺四乙酸二钠、高氯酸、氢氧化钠、氢氧化钾（均为分析纯） 天津永大化学试剂有限公司；乙酰辅酶A、乙酰肉碱转移酶 美国Sigma试剂公司；2-硝基苯甲酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；左旋肉碱标准品（纯度98.5%） 北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV2700紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司；MS204S/01电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；CT15RT高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司；TWS-24恒温水浴锅 上海喆图科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制

左旋肉碱标准储备液（78.8 μg/mL）：准确称取20 mg于（102±2） ℃烘箱中烘干2 h的左旋肉碱标准品，用去离子水定容至250 mL容量瓶。

左旋肉碱标准工作液：分别吸取左旋肉碱标准储备液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL于25 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，混匀，该系列标准溶液质量浓度分别为0.788、1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL，现用现配。

乙酰辅酶A溶液：称取20.0 mg乙酰辅酶A，溶于2.0 mL去离子水中。现用现配。

乙酰肉碱转移酶溶液：吸取100 μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，6 000 r/min离心10 min，弃去上层清液，沉淀用2 mL去离子水溶解。现用现配。

显色储备液：分别称取50 mg 2-硝基苯甲酸、5.96 mgN-2-羟乙基哌嗪-2-乙烷磺酸、185 mg乙二胺四乙酸二钠，溶于30 mL去离子水中，用10 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.4～7.6，然后用去离子水定容至50 mL。

显色工作液：吸取5.0 mL显色储备液，用去离子水定容至25 mL。

1.3.2 样品前处理

准确称取5 g（精确至0.000 1 g）混合均匀的乳粉试样于烧杯中，用30 mL 40 ℃温水溶解并转移至100 mL容量瓶中，准确加入0.25 gα-淀粉酶，混匀后于50 ℃水浴酶解30 min；取出冷却，加入10 mL体积分数13%高氯酸溶液，混匀静置20 min；用蒸馏水定容至刻度，摇匀，用定量快速滤纸过滤。

待测液制备：取滤液20 mL于50 mL离心管中，用4 mol/L氢氧化钾溶液调节pH 12.5～13.0，置于40 ℃水浴60 min；取出冷却后，先用体积分数13%高氯酸溶液调节pH 9.5～10.0，再用体积分数5%高氯酸溶液调节pH 7.0～7.5；将样液移入50 mL容量瓶，用去离子水定容，将样液置于4 ℃冰箱中过夜，取出放置至室温，用一次性医用注射器吸取上清液，通过0.45 μm水基膜过滤于50 mL离心管内，备用。

1.3.3 标准曲线绘制及试样测定

分别吸取左旋肉碱标准工作液和试样待测液2 mL于1 cm比色皿中，依次加入0.8 mL显色工作液和0.1 mL乙酰辅酶A溶液，用滴管混匀，置于分光光度计样品槽，空白比色皿中放蒸馏水。将波长设置为412 nm，5 min后归零。迅速加入0.1 mL左旋肉碱转移酶溶液，混匀，反应10 min后记录吸光度。以左旋肉碱标准工作液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线。样品中左旋肉碱含量按下式计算。

式中：ρ为从标准曲线查得的试样处理液质量浓度/（μg/mL）；V为滤液体积/mL；m为试样质量/g。

1.4 数据处理

采用Excel软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 左旋肉碱标准工作曲线优化

与GB 29989—2013相比，本研究增加吸取0.25 mL标准储备液、对应标准溶液质量浓度为0.788 μg/mL作为标准曲线第1点。依据GB 29989—2013，以标准溶液质量浓度分别为1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL绘制所得标准曲线为y=0.055 3x＋0.008 0（R2=999 9）；以标准溶液质量浓度分别为0.788、1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL绘制所得标准曲线为y=0.055 4x＋0.005 6（R2=999 9），2 条标准曲线无明显差异。标准溶液在0.789～15.776 μg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。实际样品检测过程中，部分左旋肉碱含量低于7.5 mg/100 g的特殊医学用途配方乳粉吸光度低于0.092 8（称样量5 g，吸光度0.090 9），导致结果不在第2条标准曲线范围内，测定结果不准确。质量浓度最低点（0.788 μg/mL）吸光度8 次测定结果分别为0.046 2、0.046 1、0.046 1、0.045 9、0.046 2、0.046 0、0.045 9、0.046 3，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.32%，表明该点吸光度稳定。因此，对于低含量左旋肉碱样品，检测过程应采用第2条标准曲线[21]。

2.2 乙酰肉碱转移酶溶液制备转速优化

实验中发现，乙酰肉碱转移酶悬浮液经1 500 r/min离心10 min，上清液未完全澄清，弃去上清液会导致转移酶实际含量降低。

研究乙酰肉碱转移酶悬浮液离心转速与上清液透光率的关系，透光率采用紫外-可见分光光度计直接测定。由图1可知，随着转速的增加，乙酰肉碱转移酶溶液的透光率明显增大，转速为5 500 r/min后趋于稳定，因此确定6 000 r/min为最佳转速。

图1 乙酰肉碱转移酶溶液透光率随离心转速的变化Fig. 1 Change in transmittance of acetylcarnitine transferase solution with centrifugal speed

2.3 前处理条件优化

在检测过程中发现氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊医学用途婴儿配方乳粉存在如下问题：经高氯酸沉淀蛋白质后试样溶液过滤困难，影响实验效率；制得试样备用液颜色较深，影响吸光度测定；加标回收率较低等。原因是样品配料中添加的麦芽糊精黏度较大，会附着滤纸孔，导致过滤速度较慢和滤液浑浊；同时高氯酸沉淀剂不能将其沉淀下来，堵塞滤纸孔，导致过滤较慢且滤液浑浊[21-25]。因此，通过向试样中加入淀粉酶以消除麦芽糊精的影响，本研究通过优化确定淀粉酶最优添加量及其最佳水解温度和水解时间。

2.3.1 淀粉酶添加量

5 g（精确至0.000 1 g）混合均匀的乳粉，测定淀粉酶添加量分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g时滤液的透光率。由图2可知，随着淀粉酶添加量的增加，样液透光率显著增大，并于淀粉酶添加量0.20 g之后趋于稳定，因此确定0.25 g为最佳淀粉酶添加量。

图2 样液透光率随淀粉酶添加量的变化Fig. 2 Change in light transmittance of sample solution with the amount of enzyme added

2.3.2 水解温度

测定水解温度分别为30、35、40、45、50、60、70、80 ℃时滤液的透光率。由图3可知，样液的透光率随着水解温度的增加不断增大，并且在45 ℃时基本趋于稳定，考虑到特殊医学用途婴儿配方乳粉复杂基质的影响，确定最佳水解温度为50 ℃。

图3 样液透光率随水解温度的变化Fig. 3 Change in light transmittance of sample solution with hydrolysis temperature

2.3.3 水解时间

测定水解时间分别为10、15、20、25、30、40、50、60 min时样液的透光率。由图4可知，随水解时间的延长，样液透光率逐渐增大，并在20 min后逐渐趋于稳定。考虑到特殊医学用途婴儿配方乳粉复杂基质的影响，确定最佳水解时间为30 min。

图4 样液透光率随水解时间的变化Fig. 4 Change in light transmittance of sample solution with hydrolysis time

因此，特殊医学用途婴儿配方乳粉最佳实验条件为：标准曲线以0.25 mL为最低点，乙酰肉碱转移酶悬浮液离心转速为6 000 r/min，添加α-淀粉酶0.25 g，在50 ℃时水解30 min。

2.4 实际样品测定

选取普通婴幼儿配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊医学用途婴儿配方乳粉，采用GB 29989—2013方法和本研究优化后方法测定左旋肉碱含量，并计算RSD。

由表1可知，对于普通婴儿配方乳粉，国标法测得左旋肉碱平均值为18.925 mg/100 g，RSD为2.36%，优化法测得平均值为19.063 mg/100 g，RSD为2.29%。2 种方法测得数值基本一致，且满足GB 29989—2013规定要求。对于氨基酸配方乳粉，国标法测得左旋肉碱平均值为7.875 mg/100 g，RSD为14.3%；优化法测得平均值为9.213 mg/100 g，RSD为3.71%。对于乳蛋白深度水解配方乳粉，国标法测得左旋肉碱平均值为6.275 mg/100 g，RSD为8.57%；优化法测得平均值为7.125 mg/100 g，RSD为2.57%。对于乳蛋白部分水解配方乳粉，国标法测得左旋肉碱平均值为9.938 mg/100 g，RSD为14.0%；优化法测得平均值为11.825 mg/100 g，RSD为3.93%。说明对于此3 种类型特殊医学用途婴儿配方乳粉，采用优化后的方法，样品测定精密度才符合实验室质量控制的要求[26]。

表1 2 种前处理方法测得的左旋肉碱含量（n=8）Table 1 Contents of L-carnitine in infant formula samples determined by traditional and optimized methods (n = 8)

2.5 加标回收率实验

选取普通婴儿配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方特殊医学用途婴儿配方乳粉进行加标回收率测定。

由表2可知，在3 个不同的加标水平下，对于普通婴儿配方乳粉，国标法平均加标回收率为92.475%～99.800%，RSD为1.11%～3.43%，优化法平均加标回收率为93.813%～99.900%，RSD为1.36%～2.78%。说明对于普通婴儿配方乳粉，国标法样品加标回收率和RSD符合实验质量控制要求[26]。对于氨基酸配方乳粉，国标法平均加标回收率为81.138%～84.175%，RSD为7.78%～8.69%；优化法平均加标回收率为94.138%～100.100%，RSD为3.27%～4.12%。对于乳蛋白深度水解配方乳粉，国标法平均加标回收率为83.850%～86.975%，RSD为6.68%～7.97%；优化法平均加标回收率为100.288%～102.263%，RSD为2.68%～3.07%。对于乳蛋白部分水解配方乳粉，国标法平均加标回收率为73.950%～79.775%，RSD为4.06%～6.55%；优化法平均加标回收率为89.412%～92.088%，RSD为1.71%～3.50%。说明对于特殊医学用途婴儿配方乳粉，经优化法处理样品的加标回收率和RSD符合实验室质量控制要求[26]。

表2 2 种前处理方法测得的加标回收率（n=8）Table 2 Spiked recoveries of traditional and optimized methods (n = 8)

3 结 论

优化一种特殊医学用途婴儿配方乳粉中左旋肉碱含量的测定方法。通过增加标准曲线最低点、增大酶提取离心转速、优化前处理过程等手段，解决了氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊医学用途婴儿配方乳粉试样溶液过滤困难、测定液颜色较深影响吸光度测定和加标回收率较低的问题。该方法可以缩短前处理时间，提高检测效率，满足实验室质量控制的要求。对于其他基质配方的特殊医学用途婴儿配方乳粉，该方法的适用性还需要进一步验证。