粪肠球菌W24对乌鳢生长性能、抗氧化能力及免疫功能的影响

■孔祎頔 徐 晴 李 民 尹 壮 吴雪芹 赵倩茹 窦曙光 王桂芹

（吉林农业大学动物科学技术学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118）

乌鳢（Channa argus）属鲈形目、鳢科、鳢属，是一类肉质鲜美、营养丰富的经济型鱼类，在我国大部分地区均有养殖[1-4]。近年来，由于集约化养殖的发展，乌鳢在养殖过程中易患各类疾病，严重威胁其健康[5-7]。传统方式是使用化学药物或抗生素药物治疗，而抗生素导致的诸多缺点逐渐暴露[8-10]，因此，当下迫切需要寻求一类有效的替抗添加剂来防控水产动物疾病。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类具有益生潜力的革兰氏阳性菌，也是水产动物肠道中的常见菌群之一，具有促生长、降脂、提高机体免疫功能、调节肠道菌群组成及净化水质等优点。粪肠球菌（Enterococcusfaecalis,E.faecalis）属肠球菌科，肠球菌属，对胃液、肠液及胆盐具有较强耐受能力，是《饲料添加剂品种目录（2013）》中规定的可添加到饲料中的菌种[11-14]。E.faecalis在水产养殖业的研究仍较少，仅在吉富罗非鱼（GIFT O.niloticus）[15]、奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♂×Oreochromis aureus♀)[16]、尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）[17]、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）[18]、锯缘青蟹（Scylla paramamosain）[19]等有所报道，而目前关于E.faecalis的适宜添加水平在乌鳢饲料中的研究未见报道。本研究拟通过在乌鳢饲料中添加不同浓度的E.faecalis，探究其对乌鳢的生长、抗氧化及免疫的影响，明确E.faecalis在乌鳢饲料中的适宜添加浓度，为乌鳢的健康养殖及E.faecalis在实际生产中的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲料

E.faecalisW24（GenBank：MT102746.1）从健康乌鳢肠道内容物中筛选获得并由本实验室保存；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基，均购自北京索莱宝公司；试验用乌鳢，购自山东临沂某养殖场，试验前暂养于塑料水族箱中，驯化2周，期间投喂基础饲料。基础饲料组成及营养水平见表1。饲料制成1.5 mm的颗粒，将菌悬液均匀喷洒于基础饲料，配制成6种菌液终浓度为0、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/g含E.faecalisW24试验饲料(表2及图1～图2分组时分别简写为CK、106、107、108、109、1010组)，基础饲料喷洒等体积PBS溶液作为对照组饲料，在25℃空调房晾干，每3 d制备一批新的饲料并检测饲料中E.faecalisW24活性，保存在4℃单独密封的塑料容器中。

表1 基础饲料配方及营养水平（%，干物质基础）

1.2 试验设计及饲养管理

暂养结束后，将540尾体质健康、大小一致、初始体重为（8.91±0.02）g的乌鳢，随机分配到18个塑料水族箱中，6个试验组，每组3个重复，每个重复30尾。每天9：00和16：00饱食投喂2次，饲养8周。养殖期间水温（26±2）℃；pH 7.5±0.1；氨氮＜0.5 mg/L；亚硝酸盐＜0.05 mg/L；溶解氧＞7.0 mg/L。

1.3 样品收集

8周饲养试验后，禁食24 h，计数并称重，每桶随机取10尾鱼，用100 mg/L MS-222将鱼麻醉后，于尾静脉采血，4℃静置12 h，4 000 r/min离心15 min收集血清，-20℃保存备用。在冰上快速收集肠道置于无酶离心管，液氮速冻，-80℃保存备用。

1.4 生长指标测定

使用以下公式计算成活率（SR）、平均增重率（WG）、饲料效率（FER）、特定生长率（SGR）及蛋白质效率（PER）。

成活率（SR，%）=100×（试验末存活鱼总数/试验初存活鱼总数）

平均增重率（WG，%）=100×（Wt-W0）/W0

饲料效率（FER，%）=100×（Wt-W0）/I

特定生长率（SGR，%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

蛋白质效率(PER)=（Wt-W0）/(I×C)

式中：I——摄入饲料的重量（g）；

t——试验时间（d）；

W0——试验初始时乌鳢的总重量（g）；

Wt——试验结束时乌鳢的总重量（g）；

C——饲料蛋白质的含量（%）。

1.5 抗氧化及免疫相关指标测定

肝脏和肠道中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，血清中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性及免疫球蛋白M（IgM）、补体3（C3）、补体4（C4）含量，均通过南京建成生物工程研究所试剂盒测定[20-22]。

1.6 统计分析

采用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析，用Duncan's法多重比较分析组间差异显著性程度，数据用“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，P＜0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 E.faecalis W24对乌鳢生长和饲料利用的影响（见表2）

表2 E.faecalis W24对乌鳢生长和饲料利用的影响

由表2可知，8周试验结束后，添加1.0×107、1.0×108CFU/g组和1.0×109CFU/g组乌鳢的终末体重(FBW)、WG及SGR均显著高于对照组（P＜0.05），但组间差异不显著(P＞0.05)；添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g组乌鳢的FER显著高于对照组(P＜0.05)，但组间的差异不显著(P＞0.05)；添加1.0×107、1.0×108CFU/g组乌鳢的PER显著高于对照组(P＜0.05)，但组间差异不显著(P＞0.05)；其中，添加1.0×108CFU/g组各指标值达到最高。而与对照组相比，添加1.0×106CFU/g组的FBW、WG、SGR、FER及PER均无显著差异(P＞0.05)。

2.2 E.faecalis W24对乌鳢抗氧化能力的影响(见图1)

由图1A可知，8周试验结束后，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g组乌鳢肝脏和肠道中的SOD活性均显著高于对照组(P＜0.05)，但组间差异不显著(P＞0.05)；由图1B和图1C可知，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g组乌鳢肝脏和肠道中的CAT活性及肠道中的GSH-Px活性均显著高于对照组(P＜0.05)，而与对照组相比，1.0×106、1.0×1010CFU/g组差异不显著(P＞0.05)，此外，与对照组相比，仅1.0×108CFU/g组肝脏中的GSH-Px活性显著升高(P＜0.05)，其余各组均差异不显著(P＞0.05)。由图1D可知，与对照组相比，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g组和1.0×1010CFU/g组乌鳢肝脏和肠道中的MDA含量均显著下降(P＜0.05)，其中，添加1.0×108CFU/g组达到最低值，而添加1.0×109CFU/g组和1.0×1010CFU/g组的MDA含量逐渐上升。

图1 E.faecalis W24对乌鳢肝脏和肠道抗氧化指标的影响

2.3 E.faecalis W24对乌鳢免疫功能的影响(见图2)

由图2A、C和F可知，8周试验结束后，添加1.0×107、1.0×108CFU/g和1.0×109CFU/g组乌鳢血清中的IgM含量及ACP和LZM活性均显著高于对照组（P＜0.05），但1.0×106、1.0×1010CFU/g组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；由图2B、D可知，与对照组相比，添加1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/gE.faecalisW24组乌鳢血清中的C4含量及AKP活性均显著升高（P＜0.05），但组间差异不显著（P＞0.05）；由图2E可知，仅添加1.0×107CFU/g和1.0×108CFU/g组乌鳢血清中的C3含量显著高于对照组（P＜0.05），而1.0×106、1.0×109、1.0×1010CFU/g组与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。

图2 E.faecalis W24对乌鳢血清非特性免疫指标的影响

3 讨论

3.1 E.faecalis W24对乌鳢生长和饲料利用的影响

E.faecalis在维持肠道微生态平衡、促进营养物质吸收等方面发挥重要作用[11]。在本研究中，在饲料中添加适量E.faecalisW24（1.0×107、1.0×108CFU/g）后显著提高了乌鳢的FBW、WG、FER、PER及SGR，有效促进乌鳢的生长并提高其对饲料的利用效率。饲料中添加1.5×107CFU/gE.faecalis可显著提高吉富罗非鱼SGR、WG及FER[15]。添加3.47×108CFU/gE.faecalis的饲料饲喂罗非鱼8周后，显著增加了其WG和SGR，显著降低了其饲料系数（Feed coefficient ratio，FCR）[16]。林艾影等[23]将添加不同浓度E.faecalis的饲料饲喂给军曹鱼10周后，发现添加1.0×108CFU/g和3.0×108CFU/gE.faecalis显著降低了FCR，添加1.0×108、3.0×108、5.0×108CFU/gE.faecalis显著提高了其WG和SGR。Yang等[19]发现饲料中添加1.0×109CFU/gE.faecalisY17能够提高锯缘青蟹（Scylla paramamosain）的FBW、WG及SGR等生长指标，但差异不显著。Liu等[24]研究表明，饲料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis能够显著提高仔猪的WG。朱孟玲等[25]在饲料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis，发现乳猪的生长性能得到显著提高。以上结果均表明，饲料中添加适量的E.faecalis能够促进动物的生长，与本研究结果相似，但最适添加量与动物的种类、规格、E.faecalis菌株以及饲喂周期相关。

3.2 E.faecalis W24对乌鳢抗氧化能力的影响

动物机体的抗氧化能力是保护机体免受氧化应激损伤的防御系统，SOD、CAT、T-AOC及GSH-Px是反映机体抗氧化能力的四个关键指标，MDA是脂质过氧化的产物之一，反映机体氧化损伤程度的关键指标[26]。在本试验条件下，添加1.0×107、1.0×108CFU/g和1.0×109CFU/gE.faecalisW24显著提高了乌鳢肝脏和肠道中的SOD、CAT活性并显著降低了MDA含量。用发酵乳杆菌饲喂的鲤血清中SOD、CAT和GSH-Px的含量均有所提升[27]。饲料中添加3.0×107CFU/g瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）CD6能 显 著 提 高 金 鱼（Carassius auratus）肠道中的抗氧化能力[28]，与本试验结果一致。经以上结果对比，我们发现饲料中适量添加量LAB可有效清除机体内过多的自由基，在一定程度上增强抗氧化能力，保护动物机体健康。

3.3 E.faecalis W24对乌鳢免疫功能的影响

粪肠球菌在提高机体免疫力抵抗病原侵袭等方面发挥关键作用[11，14]。ACP、AKP、LZM、lgM、C3及C4等指标常用作检测鱼类的免疫功能[29-30]。在本试验条下，8周养殖试验结束后，饲喂1.0×107、1.0×108CFU/g组血清中IgM、C3、C4含量及ACP、AKP和LZM活性显著提升，结果表明饲料中添加1.0×107、1.0×108CFU/gE.faecalisW24能够增强乌鳢的免疫功能。Liu等[24]在饲料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis，发现仔猪血浆中的IgA和IgG水平显著提高，饲喂E.faecalis能够增强免疫功能。朱孟玲等[25]研究发现饲料中添加1.0×109CFU/gE.faecalis可显著提高乳猪血清中的IgA、IgG、IgM水平。此外，将添加1.0×109CFU/gE.faecalisY17的饲料饲喂锯缘青蟹6周后，血清中LZM和SOD活性显著升高[19]。以上研究结果均表明，虽然不同E.faecalis菌株在饲料中的适宜添加量不同，但均能增强免疫功能，促进动物机体健康。

4 结论

综上所述，饲料中添加适量E.faecalisW24在一定程度上可有效促进乌鳢生长、饲料利用，增强抗氧化能力和免疫功能。在本试验条件下，乌鳢饲料中E.faecalisW24的最适添加量为1.0×107～1.0×108CFU/g。