硒与酪氨酸对凌云乌鸡抗氧化功能、免疫球蛋白、酪氨酸酶活性和黑色素含量的影响
2021-08-09张倩雲王鹏飞从光雷施寿荣谭本杰
■张倩雲 王鹏飞 从光雷 施寿荣 谭本杰*
(1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁 530004;2.中国农业科学院家禽研究所,江苏扬州 225125;3.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009)
凌云乌鸡产于广西凌云县,因其肉质细嫩甘甜、味鲜、气味香浓,黑色素含量较高而著称。然而广西地处亚热带,夏、秋两季养殖生产中鸡处于热应激的情况较常见,热应激会影响黑色素生成通路α-MSHMC1R-cAMP-TRP中相关基因的表达,从而使生成的黑色素减少。硒是动物生长代谢与繁殖必需的微量元素,在体内主要发挥抗氧化、缓解应激、保护生物膜结构的功能。黎观红等[1]在泰和乌骨鸡的基础日粮中分别添加0、0.10、0.30、0.50、0.70 mg/kg和0.90 mg/kg硒,试验结果发现当添加浓度不超过0.90 mg/kg时,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性与硒添加水平呈正相关;李卫春[2]发现日粮添加硒能显著提高肉鸡血浆中GSH-Px、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化氢酶(CAT)的活性。张华杰等[3]研究结果也表明酵母硒能显著提高血清SOD、GSH-Px活性及总抗氧化能力(T-AOC)。此外,大量研究还发现,硒可以影响动物体液免疫与细胞免疫的功能[4]。硒缺乏会导致动物机体的免疫抑制,容易受外部环境影响,使机体抗感染能力减弱。李峰等[5]研究结果表明,在肉鸡基础日粮添加0.2 mg/kg或0.3 mg/kg酵母硒,其21日龄的胸腺、脾脏和法氏囊指数显著高于基础日粮组,即酵母硒可促进肉鸡免疫器官的早期发育,从而增强免疫能力。在我国的中医药和饮食文化中,有“逢黑必补”的说法,乌骨鸡主要的滋补药用价值是其体内的黑色素。酪氨酸是黑色素合成的前体物质,在动物体内,酪氨酸在酪氨酸酶的催化下,经过一系列复杂的生物过程合成黑色素。酪氨酸酶是黑色素合成过程中主要的限速酶,是一种铜结合金属酶,在黑色素三个重要的合成步骤中发挥特征性催化作用[6]。硒可以缓解热应激,提高在热应激条件下黑色素的合成。然而关于日粮酪氨酸水平和硒水平对乌骨鸡免疫性能、酶活性及组织黑色素合成影响的研究报道不多,因此研究日粮酪氨酸水平和硒水平以及它们的交互作用对乌鸡免疫性能、酶活性及组织黑色素含量的影响,对乌鸡产业发展具有重要意义。本研究的目的是通过探究硒与酪氨酸的添加水平对13~20周龄凌云乌鸡黑色素含量及其相关酶活性的影响,确定凌云乌鸡日粮中酪氨酸与硒的最适添加量,为利用营养调控手段提高凌云乌鸡药用价值提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
试验在广西凌云县瑞东农牧有限公司开展,试验周期为13周龄至20周龄。试验采用双因素交叉设计分组,日粮硒(购买于安琪酵母股份有限公司,硒浓度为2 000 mg/kg)添加水平为0、0.2、0.3、0.4 mg/kg,酪氨酸(购买于江西百盈生物技术有限公司,纯度为99%)添加水平为0、0.2%、0.4%、0.6%,选取13周龄体重差异不显著、体况良好的凌云乌鸡576只,随机分为16组,每组3个重复,每个重复12只鸡,试验1组为对照组,试验分组见表1。
表1 试验设计及分组
1.2 饲养管理
采用玉米-豆粕-鱼粉型日粮,基础日粮为粉料,基础日粮组成及营养水平见表2。试验乌鸡均在同一鸡舍,试验之前对笼舍进行全面消毒,采用3层阶梯式鸡笼,独立乳头式饮水器,自由饮水,每天8:00和15:00进行饲喂,定期对鸡舍打扫、消毒,保持鸡舍环境干净卫生,其他饲养管理办法按该公司日常饲养管理章程进行。
表2 基础日粮组成及营养水平(风干基础)
1.3 检测指标
1.3.1 血液样品采集与制备
在20周龄末,每个重复选取1只体况相近的凌云乌鸡,禁食12 h,翅静脉采血5 mL,3 500 r/min离心10 min,将血清分离,做好标签后放入-20℃冰箱备用保存。
1.3.2 组织样品采集与制备
在20周龄末,血液采集完成后,在屠宰试验的过程中,取肝脏、肌肉、皮肤样品,剥离上面附着的结缔组织,每个组织样品采集5 g左右,放入提前做好标签的离心管中,放入-20℃冰箱中保存备用。在进行指标测定时,剪取组织样品1 g左右,于冰冷生理盐水中漂洗清除血液,用滤纸吸干水分后精确称重,用移液枪在烧杯中加入9倍重量的预冷生理盐水,将精确称重后的组织块转移至烧杯中快速剪碎,再用组织匀浆机研磨为10%的组织匀浆,将组织匀浆用低温离心机(2 000 r/min)离心10 min,取上清弃沉淀,转移到提前做好标签的预冷离心管中,放入-20℃冰箱中保存备用。
1.3.3 血清与组织酪氨酸酶活性测定
采用多巴色素法测定血清与组织中酪氨酸酶活性,将0.5 mL的L-多巴(5 mmol/L)溶液加入5 mL的离心管中,然后加入2.4 mL磷酸缓冲液,浓度为0.1 mol/L,在37℃恒温箱中孵育10 min后,用移液枪移取0.1 mL血清或组织匀浆液至离心管中振荡混匀,立刻用分光光度计测定475 nm波长下的吸光度值(A475),连续读数5 min并记录。以A475每分钟增加或减少0.001为一个酶活力单位。
1.3.4 血液与组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定
采用5,5′-二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB)法测定,试剂盒购于南京建成生物工程研究所,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3.5 组织黑色素含量测定
采用酶联免疫吸附试验(ELISA),通过抗原抗体特异性结合、底物显色,用酶标仪测得450 nm波长下的吸光度值,制作标准曲线,计算样品浓度。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行,试剂盒购于赫澎(上海)生物科技有限公司。
1.4 数据分析
试验数据先用Excel进行初步处理,之后采用SPSS 23.0对处理过的数据采用双因素方差分析,互作效应显著时再采用单因素方差分析以判断双因素之间具体的互作表现。用Duncan's法做平均数的显著性差异分析,以“平均数±标准差”来表示处理结果,P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 日粮硒与酪氨酸添加水平对凌云乌鸡血清免疫活性指标的影响(见表3)
表3 日粮硒与酪氨酸添加水平对凌云乌鸡血清免疫活性指标的影响
由表3分析可知,与对照组相比,处理组对凌云乌鸡血清中IgM浓度无显著影响(P>0.05),试验10组使凌云乌鸡血清中IgG浓度显著提高(P<0.05),试验8组显著提高了血清中IgA的浓度(P<0.05)。硒添加组、酪氨酸添加组,对凌云乌鸡血清中免疫活性指标均无显著影响(P>0.05),且硒与酪氨酸也不存在互作效应(P>0.05)。但是从整体看,日粮添加硒与酪氨酸对凌云乌鸡血清中IgG、IgA的浓度有所提高。
2.2 日粮硒与酪氨酸添加水平对血清和组织中GSH-Px及TYR活性的影响(见表4、表5)
由表4可知,添加不同水平的硒与酪氨酸对凌云乌鸡血清与组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性有不同程度的影响。血清中第11组效果最显著(P<0.05),肌肉中以第8组效果最显著(P<0.05),皮肤中以第9组效果最显著(P<0.05),肝脏中第10组效果最显著(P<0.05)。硒添加组能使血清与组织中GSH-Px的活性显著升高(P<0.05),但是与添加水平相关,高水平硒组,其酶活性低于低水平组;酪氨酸添加组对血清中GSH-Px的活性有显著升高的作用(P<0.05),对组织中GSH-Px的活性无显著影响(P>0.05);硒与酪氨酸对血清与组织中GSH-Px的活性无互作效应(P>0.05)。
表4 日粮硒与酪氨酸添加水平对凌云乌鸡血清与组织中GSH-Px活性的影响
由表5分析可知,日粮添加不同水平硒与酪氨酸对凌云乌鸡血清、肝脏、皮肤中酪氨酸酶(TYR)的活性有不同程度的影响。血清中以第15组效果最显著(P<0.05);肝脏中第9组效果最显著(P<0.05),但是第16组显著低于对照组(P<0.05);皮肤中第12组效果最显著(P<0.05)。硒添加组对凌云乌鸡血清和组织中TYR活性无显著影响(P>0.05);酪氨酸添加组能显著提高血清与皮肤中TYR活性(P<0.05);硒与酪氨酸对血清、肝脏和皮肤中TYR活性存在互作效应,并显著提高血清和肝脏、皮肤TYR活性(P<0.05),随着添加水平增高,其活性会有所下降。
表5 日粮硒与酪氨酸添加水平对凌云乌鸡血清与组织中TYR活性的影响
2.3 日粮硒与酪氨酸添加水平对血清和组织中黑色素含量的影响(见表6)
由表6分析可知,日粮添加不同水平硒与酪氨酸对凌云乌鸡肌肉、肝脏、皮肤中黑色素含量有不同程度影响。与对照组相比,肌肉中第5组黑色素含量最高(P<0.05),肝脏中黑色素含量最高的组为第2组(P<0.05),皮肤中第9组黑色素含量最高(P<0.05)。硒添加组显著提高了凌云乌鸡皮肤中黑色素含量(P<0.05);酪氨酸添加组显著提高了肌肉中黑色素含量(P<0.05);硒与酪氨酸对肌肉、肝脏和皮肤中黑色素的含量的影响存在互作效应(P<0.05),能够显著提高凌云乌鸡肌肉、肝脏和皮肤中黑色素含量。
表6 日粮硒与酪氨酸添加水平对凌云乌鸡组织中黑色素含量的影响
3 讨论
3.1 日粮硒与酪氨酸添加水平对凌云乌鸡免疫活性指标的影响
IgA、IgM和IgG是血清免疫球蛋白中最重要的3类,IgA主要参与机体黏膜表面的体液免疫应答,IgM是初次免疫应答中最早产生的免疫球蛋白,IgG是自然感染和人工主动免疫后机体产生的主要抗体[7]。张立恒[8]发现日粮酪氨酸与苯丙氨酸的水平对丝毛乌骨鸡的机体蛋白代谢与免疫功能无显著影响。杨清丽等[9]发现,日粮添加硒可以显著提高产蛋鸡血清中总蛋白、白蛋白和IgA、IgM的含量。Cai等[10]对1日龄的肉鸡研究时发现,饲粮中添加0.3 mg/kg纳米硒,饲喂21 d时各试验组血清IgG、IgM、IgA含量均无显著提高,然而饲喂42 d后能显著提高血清IgG、IgM的含量,并且0.5 mg/kg纳米硒组血清IgG、IgM的含量显著低0.3 mg/kg纳米硒组。本试验结果表明,日粮中单独添加硒或单独添加酪氨酸都不会对血清免疫球蛋白产生影响。与对照组相比,10组对血清中IgG的含量有显著提高作用,10组日粮硒与酪氨酸添加水平为0.2 mg/kg、0.6%,8组对血清中IgA的含量有显著提高作用,8组日粮硒与酪氨酸添加水平为0.2 mg/kg和0.2%。由此可知,硒和酪氨酸存在互作效应,说明硒提高家禽的免疫功能还跟酪氨酸的含量有关,本研究结果表明,单独添加硒或酪氨酸都不能提高鸡的免疫功能。
3.2 酪氨酸与硒添加水平对组织相关酶活性的影响
谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心是硒半胱氨酸,硒是GSH-Px的必需成分,GSH-Px活力也可以作为衡量机体硒水平的一项指标。硒可以通过作用于GSH-Px来发挥抗氧化作用,保护动物机体细胞的完整并维持功能正常[11]。张增源[12]的研究结果表明,基础日粮中添加0.2 mg/kg和0.3 mg/kg的酵母硒对血清中GSH-Px的活性有显著提高作用,且酵母硒使用效果比亚硒酸钠更显著。Surai[13]发现富含硒蛋孵化雏鸡时,肝脏GSH-Px的活性不仅在孵化时较高,而且在孵化后5 d也比普通蛋所孵化的雏鸡高。陈国顺等[14]在不同硒源对肉鸡抗氧化能力的研究中发现,酵母硒能显著提高肉鸡肝脏和血清中GSH-Px的活性。硒与日粮中的营养元素可能会发生互作效应,郑嫩珠等[15]对半番鸭的研究发现,酵母硒与黄芪多糖组合能显著提高半番鸭肌肉中GSH-Px的活性。孙春阳等[16]研究发现,以葡萄糖氧化酶和酵母硒为主要成分的复合添加剂,使21日龄和42日龄肉鸡血清GSH-Px的活性分别显著提高了8.9%、12.3%。据王兴华等[17]报道,在日粮中添加0.8 mg/kg的硒能显著提高白羽肉鸡血清和肝脏中GSH-Px的活性。硒的抗氧化作用非常大,因此硒的添加量要适量适度,动物摄入过量硒会对机体产生毒害作用,抑制其抗氧化功能。本试验结果表明,日粮中添加硒能显著提高凌云乌鸡血清、肝脏、肌肉和皮肤中GSH-Px的活性;添加酪氨酸显著提高了血清中GSH-Px的活性,硒与酪氨酸对凌云乌鸡血清和组织中GSH-Px的活性无互作效应。
酪氨酸是黑色素合成的前体物质,在动物体内酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下,经过一系列复杂的生物过程合成。酪氨酸酶是黑色素合成过程中主要的限速酶,是一种铜结合金属酶,在黑色素三个重要的合成步骤中发挥特征性催化作用[6]。赵艳平等[18]在对1~12周龄的泰和乌骨鸡研究中发现,在三个生长阶段分别提供1.18%、0.88%和1.25%水平的酪氨酸,能显著提高乌骨鸡血清酪氨酸酶的活性。王兰梅等[19]发现,饲喂马来西亚红罗非鱼0.5%、1%、2%三个酪氨酸水平的饵料,酪氨酸水平为2%组皮肤与血清中酪氨酸酶的活性显著高于0.5%组。黄燕等[20]研究结果表明,日粮添加硒能显著提高乌蒙乌鸡皮肤、肌肉、肝和肾中酪氨酸酶的活性。据黎观红等[1]报道,日粮适量添加硒,能够提高泰和乌骨鸡血清及组织酪氨酸酶的活性。许兰娇[21]发现日粮添加硒能够在一定程度上提高热应激状态下泰和乌骨鸡组织酪氨酸酶的活性。也有报道称日粮的铜添加水平对酪氨酸酶的活性产生影响[22-23]。本试验结果表明,日粮添加硒对凌云乌鸡血清中酪氨酸酶的活性有提高趋势,添加酪氨酸能显著提高血清与皮肤中的酪氨酸酶的活性,硒与酪氨酸对凌云乌鸡血清、肝脏和皮肤存在互作效应。
3.3 酪氨酸与硒添加水平对组织黑色素含量的影响
黑色素具有清除自由基抗氧化、防辐射防诱变、抗衰老、富集微量金属元素等生物功能[24]。乌骨鸡与普通肉鸡的最大区别在于乌骨鸡体内含有大量的黑色素,乌骨鸡在入药或作为滋补品时,黑色素含量是评价药用或滋补功效的重要指标。黑色素合成的底物是酪氨酸,因此当乌骨鸡合成大量的黑色素时,日粮的酪氨酸供应量需要满足其需求。大量研究表明,动物机体维持氧化/抗氧化平衡对黑色素合成具有重要意义,动物热应激会使机体内部氧化代谢增加,造成过氧化物增加,打破机体内部氧化/抗氧化平衡,破坏细胞的膜结构[25]。同时,热应激会影响黑色素生成通路α-MSH-MC1R-cAMP-TRP相关基因的表达,从而影响黑色素的生成[21]。硒最重要的生物功能就是抗氧化功能,消除过多自由基,从而保护生物体的膜结构与功能,可以缓解因热应激而造成的黑色素合成减少。黎观红等[26]发现日粮酪氨酸添加量在一定范围内可以提高泰和乌骨鸡组织黑色素含量。Watson等[27]发现在犬类的日粮中提高酪氨酸+苯丙氨酸的比例,其毛色会因黑色素沉积而呈现黑色。据Wang等[28]报道,提高饵料中酪氨酸含量会导致罗非鱼腹部与背部皮肤黑色素含量的提高。赵艳平等[29-30]对1~4、9~12周龄泰和乌骨鸡研究发现,日粮酪氨酸水平在0.98%~1.25%时,可以显著提高乌骨鸡肌肉、肝脏、心脏、皮肤中黑色素含量。张竹英[31]对泰和乌骨鸡进行急性热暴露研究黑色素含量变化,研究发现热应激条件下12 h和24 h,能降低组织抗氧化能力,并且组织黑色素含量有下降的趋势。许兰娇[21]发现,在日粮中添加0.3、0.5、0.7 mg/kg硒,可以提高热应激条件下泰和乌骨鸡组织黑色素含量。熊小文等[32-33]对5~8、9~12周龄泰和乌骨鸡研究发现,在日粮中添加0.3~0.5 mg/kg的硒,可以提高乌骨鸡组织黑色素含量。有学者报道,动物组织中硒含量与黑色素含量有一定关系[34]。本试验结果表明,日粮添加硒与酪氨酸能够提高凌云乌鸡组织黑色素含量,且硒与酪氨酸对组织黑色素含量存在互作效应。综合肌肉、肝脏、皮肤黑色素含量分析,试验9组即当日粮硒与酪氨酸添加量为0.2 mg/kg和0.4%时,凌云乌鸡组织黑色素含量相对较高。硒与酪氨酸添加量过高时,凌云乌鸡组织黑色素含量减少,这在互作组表现尤为明显,这可能是硒与酪氨酸添加过量抑制黑色素的生成,或是高水平的硒与酪氨酸互作效应能抑制凌云乌鸡黑色素生成。
4 结论
日粮添加硒与酪氨酸在一定程度上可以增强凌云乌鸡的免疫力,提高凌云乌鸡血清与组织谷胱甘肽过氧化物酶、酪氨酸酶的活性,并提高组织黑色素的含量。综合谷胱甘肽过氧化物酶、酪氨酸酶的活性及对黑色素的含量分析,基础日粮中单独添加0.2 mg/kg硒或者单独添加0.6%的酪氨酸的效果最好。硒与酪氨酸交互作用得到基础日粮中添加0.2 mg/kg和0.4%的硒与酪氨酸时效果最好。综合上述指标分析,当日粮硒与酪氨酸的水平为0.4 mg/kg和0.98%时,可以提高作为乌鸡药用价值重要指标之一黑色素的含量。