基于大肠杆菌感染模型探讨益生菌对断奶仔猪生长性能影响的研究进展

■葛长荣 柳成东 程志斌

（云南农业大学，云南昆明 650201）

断奶仔猪细菌性腹泻致使生长迟滞、死亡率高，给全球养猪业造成巨大经济损失（Roussel等，2017；Barba-Vidal等，2018）。其中，产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）破坏肠道菌群平衡、损伤肠道正常形态、引发炎症反应，对断奶仔猪生产的危害最突出（Liu等，2018；Luise等，2019）。以往针对性应用显著抑制ETEC的多种饲用抗生素，能够降低断奶仔猪腹泻，进而改善生产性能（Xu等，2020；Wang等，2020a；Wang等，2020b）。然而，随着我国饲料工业全面禁止促生长药物饲料添加剂的使用（农业农村部第194号公告），研发替代抗生素新产品的试验模型、实验技术及其效果成为行业焦点（Liu等，2018；Luise等，2019；柳成东等，2020a）。

饲用益生菌是一类用以维持动物肠道微生态平衡和改善动物机体生理生化的功能性添加剂（Barba-Vidal等，2018；葛长荣等，2019；柳成东等，2020b）。大量科学试验表明（黄遵锡等，2017；Czech等，2018；Wang等，2019；黄遵锡等，2020；Tsukahara等，2020），养殖卫生状况良好的试验猪场，应用益生菌替代饲用抗生素，断奶仔猪获得了良好的生长性能及生产效益。然而，放眼全球及我国，实际养猪业的卫生状况差异较大，以往基于环境卫生控制良好的科学试验及报道是否能支撑益生菌在断奶仔猪生产中的普遍应用，值得采用更多的试验模型、控制差异化的试验条件，进一步深入研究。本文综述了经典的ETEC感染试验模型评估断奶仔猪应用益生菌的部分成果，以期为益生菌替代饲用抗生素的应用提供更多的科学依据。

1 ETEC感染断奶仔猪试验模型

通过口服适合剂量的ETEC K88、ETEC K99等典型毒株，模拟实际养殖卫生较差的生产状况，诱发断奶仔猪严重腹泻及生长迟滞，来构建ETEC感染断奶仔猪试验模型，并用于益生菌等功能性添加剂的效果评估及机制研究（Liu等，2018；Luise等，2019）。为了保障试验数据的科学性、准确性和普遍性，成功构建ETEC感染断奶仔猪试验模型的关键点包括（Liu等，2018；Luise等，2019）：①毒株的选择与评估。ETEC感染试验所用毒株的类型（包括ETEC K88、ETEC K99）及毒力，需在仔猪口服试验之前进行合理的实验室评估，以获得仔猪致泻的普遍性。②毒株的口服量。依据感染毒株类型、毒力及试验所选仔猪，确定适合的口服剂量，以获得腹泻的模型效果，且需要避免较高的死亡率。③试验仔猪的选择。试验仔猪的品种、性别，断奶日龄、体重，感染日龄、体重及持续感染时间等诸多因素，不仅影响模型的构建，更加影响益生菌等功能性添加剂应用的评估效果。

基于以上因素，表1汇总的文献数据聚焦ETEC感染对断奶仔猪生长性能、肠道菌群、肠道形态和炎症细胞因子的影响以及应用益生菌的作用效果。

2 ETEC感染对断奶仔猪生长性能的影响及益生菌的作用效果

2.1 ETEC感染对断奶仔猪生长性能的影响

首先，ETEC感染造成断奶仔猪生长迟滞。表1汇总数据显示，与不感染ETEC的对照组（Control group，C）相比，感染组（Challenged group，CH）仔猪平均日增重的下降幅度11.9%～30.7%（Wang等，2009；Lee等，2012）。Wang等（2009）对21日龄断奶仔猪、感染2×109CFU/头、持续感染10 d，发现CH组仔猪平均日增重比C组显著降低11.9%。Lee等（2012）对34日龄断奶仔猪、感染5×109CFU/头、持续感染14 d，结果显示CH组仔猪平均日增重比C组显著降低30.7%。进一步分析，Wang等（2009）和Lee等（2012）报道显示：与C组相比，CH组仔猪平均日采食量的下降幅度9.5%～16.0%。因此，ETEC感染导致的采食量下降是仔猪生长迟滞的原因之一。

其次，ETEC感染造成断奶仔猪料重比上升。表1汇总显示，ETEC感染造成仔猪料重比的上升幅度1.6%～21.3%（Lee等，2012；Pan等，2017）。Pan等（2017）对30日龄断奶仔猪、感染1×1010CFU/头、持续感染3 d，结果显示：与C组相比，CH组仔猪的料重比增加1.6%。Lee等（2012）报道，与C组相比，CH组仔猪的料重比显著增加21.3%。此外，Pan等（2017）和Pu等（2018）报道，CH组仔猪腹泻指数比C组增加了44.0～83.3百分点。

表1 ETEC感染对断奶仔猪生长性能的影响及益生菌的作用效果

上述结果及分析表明：口服ETEC不同程度地降低了采食量、增加了腹泻发生概率，显然均不利于仔猪对饲料营养物质的消化与吸收，这是ETEC感染仔猪生长性能低下的原因之一，且具体指标的降低幅度由仔猪感染程度决定（Lee等，2012；Pan等，2017；Pu等，2018）。分析ETEC感染模型的条件表明，仔猪感染程度受到诸多因素影响，包括试验仔猪断奶日龄和体重、感染日龄和体重、ETEC感染剂量和持续处理时间等（见表1）。

2.2 益生菌对ETEC感染断奶仔猪生长性能的影响

表1汇总数据显示：与C组相比，感染ETEC并使用益生菌的处理组（ETEC challenged and probiotics supplemented group，CH+P）仔猪平均日增重的变化幅度-2.0%～+20.8%（Lee等，2012；Pan等，2017）。Lee等（2012）通过持续感染14 d的ETEC模型研究显示：与C组相比，使用单一益生菌植物乳杆菌的CH+P组仔猪平均日增重显著增加20.8%。Pan等（2017）通过感染3 d的ETEC模型试验发现：与C组相比，使用复合益生菌的CH+P组仔猪的平均日增重只下降了2.0%，且统计差异不显著。

与C组相比，CH+P组仔猪平均日采食量的变化幅度-5.6%～+12.7%（Wang等，2009；Che等，2017），料重比的变化幅度-9.6%～+0.7%（Lee等，2012；Che等，2017），且C组和CH+P组之间平均日采食量和料重比均差异不显著。值得关注的是，Pan等（2017）和Pu等（2018）的报道显示：益生菌显著降低ETEC感染仔猪的腹泻率，且单一使用抑菌性能较强的凝结芽孢杆菌对改善仔猪腹泻的效果优于复合益生菌（地衣芽孢杆菌和酿酒酵母菌）（表1）。

分析以上ETEC感染模型的仔猪生长性能数据表明（表1）：ETEC感染仔猪的腹泻增加以及采食量下降、料重比升高，是断奶仔猪生长迟滞的关键原因。饲用益生菌通过降低腹泻的发生而改善了仔猪增重，且这一改善效果受到益生菌种类、添加量及仔猪感染程度的影响。以上提示：益生菌在体内、体外抑菌的作用及降低断奶仔猪腹泻的效果是未来研究的重点，这也凸显本文综述ETEC感染试验模型的重要性（Liu等，2018；Luise等，2019）。

3 ETEC感染对断奶仔猪肠道菌群的影响及益生菌的作用效果

3.1 ETEC感染对断奶仔猪肠道菌群的影响

肠道菌群平衡是断奶仔猪肠道健康及良好生长性能的重要保障（Pluske等，2018；Guevarra等，2019）。ETEC等致病性大肠杆菌是仔猪肠道的主要有害菌，不利于生长性能；乳酸杆菌和双歧杆菌是仔猪肠道的优势有益菌，对保障断奶仔猪肠道健康及良好生长性能具有重要意义。表2汇总数据显示：①就大肠杆菌而言，与C组相比，CH组仔猪粪便中上升幅度400.0%～2 042.9%（Zhang等，2010；周栋，2015）；盲肠食糜中上升幅度99.5%～1 021.2%（Pan等，2017；Pu等，2018）；空肠食糜中上升约866.7%（Pu等，2018）；结肠食糜中上升幅度350.0%～408.0%（Che等，2017；徐琴，2017）。②就乳酸杆菌而言，与C组相比，CH组仔猪粪便中下降幅度75.0%～84.5%（Zhang等，2010；周栋，2015）；盲肠食糜中下降幅度80.0%～98.5%（Pan等，2017；Pu等，2018）；空肠食糜中下降约56.7%（Pu等，2018）；结肠食糜中下降幅度77.5%～87.5%（Che等，2017；徐琴，2017）。③就双歧杆菌而言，与C组相比，CH组仔猪粪便中下降幅度67.5%～91.3%（Zhang等，2010；周栋，2015）；盲肠食糜中下降约27.7%（Pu等，2018）；空肠食糜中下降约11.4%（Pu等，2018）；结肠食糜中下降约20.7%（Che等，2017；徐琴，2017）。以上数据表明，ETEC感染仔猪的肠道菌群失衡，表现在有害菌大肠杆菌的数量上升、有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌数量下降，这是仔猪高腹泻的关键原因。

表2 ETEC感染对断奶仔猪肠道菌群的影响及益生菌的作用效果

3.2 益生菌对ETEC感染断奶仔猪肠道菌群的影响

Pu等（2018）通过5 d的ETEC感染试验模型证明，与对照组相比，饲粮添加1×106CFU/g凝结芽孢杆菌显著降低ETEC感染仔猪肠道食糜的大肠杆菌数量，同时显著增加乳酸杆菌和双歧杆菌。Che等（2017）通过3 d的ETEC感染模型发现，与对照组相比，1×107CFU/g饲用酵母菌显著降低ETEC感染仔猪肠道食糜的大肠杆菌数量，但对乳酸杆菌和双歧杆菌没有显著作用效果。Pan等（2017）通过3 d的ETEC感染模型发现，饲粮添加9×106CFU/g复合益生菌（地衣芽孢杆菌和酿酒酵母菌）能恢复ETEC感染的仔猪肠道菌群至对照组正常的水平。上述报道表明：①总体而言，饲用益生菌具有进一步优化和（或）维持断奶仔猪肠道菌群的作用，且这一作用效果受益生菌种类、添加量及仔猪肠道菌群失衡程度的影响；②复合益生菌对维持或优化肠道菌群的作用效果不一定优于单一饲用益生菌，这显然与益生菌的抑菌性能有关。据此，本课题组查找了有关凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌等抑菌性能评估的体外试验报道。

益生菌抑菌性能评估的体外试验常见方法包括：牛津杯法（Majeed等，2016；Fu等，2018）、最小抑菌浓度法（郭丰庆等，2020）、杀菌能力法（Pan等，2013）、平板划线法（陈桂芳等，2018）等。大量牛津杯法体外抑菌实验报道显示，凝结芽孢杆菌对ETEC K88具有直接抑制作用，其抑菌效果达到“中度敏感”水平（汪攀等，2017；张韵等，2017）；国外少量体外抑菌实验文献显示，地衣芽孢杆菌对ETECK88的抑菌作用达到“中度敏感”或“低度敏感”水平（Wang等，2010；Shobharani等，2015）；目前，没有酵母菌直接抑制ETEC效果的体外实验报道。有综述认为饲用酵母菌在畜禽肠道内主要通过与病原菌竞争营养物质和结合位点，间接实现肠道菌群的平衡（袁园等，2018；汪棋等，2020）。此外，Pothoulakis等（1993）体外实验发现，酵母菌分泌的二种蛋白酶具有降解肠毒素的作用，这对饲用酵母菌平衡肠道菌群可能有积极作用。

综合以上凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌3种益生菌体内调控肠道菌群数据、体外抑菌作用的效果，提示复合益生菌的饲用效果不一定优于单一益生菌。未来饲用益生菌应用的关键技术是明确单一益生菌的抑菌效果、揭示单一益生菌抑菌作用机制，随后合理组合不同菌株及比例，达到协同抑制多种肠道有害菌的最佳效果。

4 ETEC感染对断奶仔猪肠道形态的影响及益生菌的作用效果

4.1 ETEC感染对断奶仔猪肠道形态的影响

肠黏膜绒毛高度、隐窝深度是表征肠道形态的最直观指标（Ji等，2019；黄遵锡等，2020）。完整且较长的绒毛高度和适当的隐窝深度有利于营养物质的充分吸收；相反，肠黏膜上皮细胞被破损会显著降低绒毛高度，且增加隐窝深度，这是隐窝干细胞增殖、增生对肠绒毛上皮细胞的损伤修复作用（Chen等，2019；Ji等，2019）。表3汇总数据显示：与C组相比，CH组仔猪空肠绒毛高度的下降幅度11.7%～26.0%（Che等，2017；Pan等，2017）；回肠绒毛高度的下降幅度11.0%～34.3%（Che等，2017；Pan等，2017）；然而，隐窝深度的变化，两组之间未达到统计差异的水平。由此可见，ETEC感染仔猪模型条件下，肠道损伤最直观的表现是小肠绒毛高度的显著降低。由于小肠绒毛上皮细胞主要功能之一是营养的消化与吸收，显然小肠绒毛降低不利于营养消化与吸收，这也是ETEC感染仔猪生长迟滞的主要原因之一。

表3 ETEC感染对断奶仔猪肠道形态的影响及益生菌的作用效果

4.2 益生菌对ETEC感染断奶仔猪肠道形态的影响

Che等（2017）通过高剂量1×1011CFU/头的ETEC感染模型发现，与C组相比，饲粮添加1×107CFU/g酵母菌的CH+P组仔猪空肠绒毛高度显著降低17.3%、回肠绒毛高度显著降低20.3%。Barba-Vidal等（2017）通过低剂量3×1010CFU/头的ETEC感染模型发现，与C组相比，使用8×106CFU/g长双歧杆菌的CH+P组仔猪回肠绒毛高度降低11.5%，但两组之间统计差异不显著。Pan等（2017）采用更低剂量1×1010CFU/头的ETEC感染模型发现，与C组相比，饲粮添加9×106CFU/g复合益生菌的CH+P组仔猪空肠绒毛高度降低1.6%、回肠绒毛高度降低2.7%，且两组之间空肠和回肠的绒毛高度数据统计差异均不显著。以上结果表明：饲用益生菌一定程度上恢复了ETEC感染仔猪的损伤肠道，且这一作用效果受到ETEC攻毒剂量造成的肠损伤程度影响。

5 ETEC感染对断奶仔猪炎症细胞因子的影响及益生菌的作用效果

5.1 ETEC感染对断奶仔猪血清炎症细胞因子的影响

炎症细胞因子是表征仔猪感染程度及免疫保护的一类重要指标，炎症细胞因子一般可分成二类，即促炎因子和抗炎因子（Tanaka等，2018；Ouyang等，2019；王乙茹等，2020）。表4汇总了ETEC感染仔猪试验模型中血液常规检测的TNF-α、IL-6、INF-γ等促炎因子和IL-10抗炎因子的浓度，结果显示：①就促炎因子TNF-α而言，与C组相比，CH组仔猪血液中浓度的上升幅度28.6%～159.9%（Wang等，2009；周栋，2015）；②就促炎因子IL-6而言，与C组相比，CH组仔猪血液中浓度的上升幅度17.4%～83.0%（Zhang等，2010；Lee等，2012）；③就促炎因子INF-γ而言，与C组相比，CH组仔猪血液中浓度的上升幅度81.7%～82.0%（Wang等，2009；Lee等，2012）；④与C组相比，CH组仔猪血液中IL-10抗炎因子浓度下降17.4%（周栋，2015）。以上数据表明：血液炎症细胞因子可以反映ETEC及所产肠毒素造成的断奶仔猪炎症反应，且炎症反应程度受到试验仔猪感染日龄和体重、ETEC处理剂量和持续时间等因素影响。

5.2 益生菌对ETEC感染断奶仔猪血清炎症细胞因子的影响

进一步分析表4数据显示：除了Wang等（2009）的报道，与C组相比，应用各类益生菌的CH+P组仔猪血液TNF-α浓度的变化幅度-7.9%～+50.0%（Zhang等，2010；周栋，2015），与CH组仔猪TNF-α变化幅度28.6%～159.9%相比较，有了较大程度的缓解作用；且促炎因子IL-6和INF-γ也显示相似的规律。以上结果提示，益生菌对ETEC感染仔猪的炎症反应有一定缓解作用。

表4 ETEC感染对断奶仔猪血清炎症细胞因子含量的影响及益生菌的作用效果

由于益生菌的种类繁多、代谢产物复杂，因此不同种属的益生菌对炎症细胞因子的缓解效果及机制有较大差异，表4汇总数据也证明了这一点观点。现有的综述文献表明（Vieco-Saiz等，2019；付一鸣等，2019），益生菌对ETEC感染仔猪炎症细胞因子的影响及缓解机制包括：①益生菌与外源肠道有害菌的竞争定植机制；②益生菌对肠黏膜上皮细胞的保护机制；③益生菌代谢产物对肠毒素的清除机制；④益生菌及代谢产物激活肠黏膜组织细胞的抗炎机制。尤其需要关注的是，单一益生菌（例如：丁酸梭菌）可能具备以上一种或多种机制，影响炎症细胞因子表达而缓解ETEC感染仔猪的炎症反应（王腾浩，2015）。因此，合理地将多个益生菌复配可能获得更好的抗炎促生长效果（周栋，2015），诚然这需要更加深入细致的研究。

6 小结

鉴于实际养猪生产差异化的卫生状况，在禁抗的全球行业发展趋势下，本文综述了ETEC感染试验模型评估断奶仔猪应用益生菌的部分成果。ETEC感染处理显著降低断奶仔猪生长性能、破坏肠道菌群平衡、损伤肠道组织形态、引发炎症反应；应用益生菌通过平衡肠道菌群、维持肠道形态、缓解炎症反应等作用，一定程度上改善了ETEC感染仔猪的生长性能。本文为益生菌在实际养猪生产中的评估与应用，提供了更多的思路。