四环素的毒性预测与验证

■赵军杰 程林丽，2，3* 栾业辉 韩鸿飞

（1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.国家兽药残留基准实验室，北京 100193；3.动物源食品安全检测技术北京市重点实验室，北京 100193）

抗生素因具有防治动物感染性疾病以及促进生长等作用得到广泛应用[1]，但其产生的毒性作用风险往往被忽视。特别近年来抗生素滥用现象较普遍，未被代谢的抗生素残留在动物机体，部分随排泄等途径进入水体和土壤，并通过食物链进行生物富集，对环境、食品安全以及人类健康产生了一定的威胁。因此，对畜牧兽医生产中的抗生素应用进行全面的毒性风险评估是十分必要的。

四环素类抗生素（tetracyclines，TCs）是一类广谱抗生素，广泛应用于革兰氏阳性菌及阴性菌引起的疾病感染治疗，对立克次氏体、支原体、衣原体以及某些螺旋体和原虫具有较强的抑制作用。TCs低剂量可以用来促进禽畜生长，高剂量可以用来防治感染性疾病，并且具有抗菌活性好及成本低廉等优点，因此被广泛应用于养殖业。据报道，TCs是我国动物养殖业使用量最大的抗生素，其生产量和使用量在国内均为第一。但由于其在动物体内吸收较少，大部分以原形或代谢物的形式排出体外，随排泄途径进入环境，具有潜在环境风险，并可通过食物链富集从而对人体健康产生较大危害。因此在应用四环素类抗生素的同时，不能忽视其产生的毒性作用风险。四环素作为四环素类抗生素的典型代表，目前毒性作用已有不少报道，包括遗传毒性及肝脏毒性等，但对其毒性研究并不全面。

长期以来，各国政府部门认可的药物毒理学评价基本都通过传统的毒理实验进行。这些方法多为动物实验或分子水平实验，实验耗费高、周期长且效率较低。因此迫切需要开发快速且低成本的替代方法来进行药物的毒性评价。近10年来，通过以采集各种数据库的实验数据建立定量构效关系（包括化合物结构与毒性之间的关系）模型为基础的计算机辅助药物设计预测软件不断开发和完善，其中不少软件预测模型形象直观并且准确度较高，已成为最重要的药物毒性预测方法之一，其中以QSAR为模型开发的毒性预测软件已逐步应用于新药研发和药理毒理研究过程中，大大缩短了药物毒性作用评估时间以及试验成本，能够为药物毒性评价提供有效参考。

因此，本文采用应用比较广泛的软件之一ADMET Predictor 6.5的毒性预测模块对四环素进行毒理学评价，分析和讨论各个毒性参数预测结果与文献报道结果的契合度，以期能为四环素的毒性风险评估和毒理机制研究提供参考。

1 材料与方法

ADMET Predictor 6.5软件（美国凡默谷公司开发的ADME/Tox性质预测与化合物设计软件）。

在Drug Bank中下载四环素2D分子结构文件，保存为MOL格式，将此格式文件导入ADMET Predictor 6.5软件进行毒性作用预测。主要预测四环素的急性毒性、致突变性、致染色体变异性、致癌性、生殖毒性以及潜在肝脏毒性，包括碱性磷酸酯酶(AlkPhos)、谷酰转肽酶(GGT)、乳酸盐脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）指标的影响。各毒性模块对应的毒性参数及界限值见表1。

表1 毒性预测模块对应参数及界限值*

2 结果与分析

2.1 急性毒性预测结果和文献数据比较

以大鼠为动物模型进行急性毒性预测，毒性终点为半数致死浓度LC50，即表示引起50%受试对象死亡的药剂浓度，单位为mg/L。对于大多数药物，软件设定急性毒性预测参数（TOX_Rat）LC50大于等于300时不具有急性毒性。而文献大多以半数致死剂量LD50来评价四环素的急性毒性，即能够引起试验动物一半死亡的药物剂量，单位为mg/kg。

软件预测获得四环素的LC50值为1 092.84 mg/L，该值远大于300 mg/L，即四环素对大鼠急性毒性很低。文献检索到大鼠半数致死剂量LD50为807 mg/kg，依据急性毒性分级标准（表2）判断四环素属于低毒性药物。预测结果与文献报道基本一致。

表2 小鼠经口急性毒性分级标准

2.2 致突变性预测结果和文献数据比较

细菌回复突变试验（Ames实验）利用鼠伤寒沙门氏菌来检测点突变，原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。

ADMET Predictor提供了一套共10株的沙门氏菌（表3）建立致突变预测模型TOX_MUT_***，预测化合物在不同沙门菌属Ames试验中的致突变可能性，输出结果为“阴(-)/阳(+)”。程序提供了致突变性打分规则进行综合打分。预测结果TOX_MUT_Risk为2，即判定四环素无致突变性。

表3 10株鼠伤寒沙门氏菌*

Akiko等研究四环素和亚硝酸盐的协同致突变性，结果显示，加入S9-Mix的情况下，四环素和亚硝酸盐共存时，观察到沙门氏菌TA100标准株回复突变体显著增加。但无论S9-Mix存在与否，四环素在0.2～1.0μg/板时对沙门氏菌TA98和TA100两个标准株均无明显致突变性。预测结果和实验结果保持一致。

2.3 致染色体变异性预测结果和文献数据比较

致染色体变异性参数为TOX_CABR，其预测结果为“是”和“否”两种。软件预测结果为Nontoxie（56%），即四环素具有致染色体变异性。

微核试验通过检测受试物是否引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞染色体或有丝分裂器损伤而诱导微核细胞发生率增高，以评价受试物致突变的可能性。吴亦帆等通过观察盐酸四环素各剂量组小鼠骨髓细胞染色体切片，发现环状染色体出现的概率为23.5%，染色单体断裂概率为23%；并进行了微核试验，发现随着盐酸四环素给药剂量的增加，嗜多染红细胞微核率呈线性增加。以上实验结果说明盐酸四环素具有致染色体变异的可能性。预测结果和文献报道结果基本一致。

2.4 致癌性预测结果和文献数据比较

用半数致癌浓度TD50来评估大小鼠致癌性参数TOX_BRM_Rat和TOX_BRM_Mouse。TD50为使受试动物完整暴露期间，半数动物患肿瘤所需的药物剂量。软件预测结果为大鼠TD50为238.4 mg/(kg·d)，小鼠TD50为1 721.9 mg/(kg·d)，即四环素没有致癌性。

Dietz等在大鼠小鼠中进行了为期两年的盐酸四环素致癌性研究。通过饲料连续暴露于0、12 500 mg/kg或25 000 mg/kg的抗生素水平下。研究结果发现增生性变化（增生、腺瘤和腺癌）的总发生率不受抗生素暴露的影响，即盐酸四环素对大鼠和小鼠均无致癌性，并且发现盐酸四环素对某些自发性肿瘤可能具有保护作用。预测结果和文献报道结果一致。

2.5 生殖毒性预测结果和文献数据比较

生殖毒性参数TOX_REPR的预测结果为“是”和“否”两种。软件输出四环素生殖毒性预测结果为“Nontoxic（80%）”，即四环素无生殖毒性。

研究发现，大鼠连续给高剂量四环素[28.6、30、10、40、200 mg/(kg·d)]，会引起大鼠睾丸、附睾和精囊相对重量显著降低，且附睾精子活力、活精子百分比、精子数降低以及异常精子形态增加。分子水平研究发现，四环素可导致大鼠超氧化物歧化酶以及血清睾酮含量下降，丙二醛含量增加，表明四环素通过诱导氧化应激引起雄性大鼠精子毒性和睾丸毒性。但长期摄入5 mg/kg剂量四环素对雄性Wistar大鼠生精功能无明显影响，对于雌性大鼠，低剂量盐酸四环素[1.2 mg/(kg·d)和4.8 mg/(kg·d)灌胃90 d]对大鼠子宫没有明显的副作用，Steiner等在雌鼠交配前染毒1 d，发现高剂量四环素（100 mg/kg）对雌鼠子宫和宫颈均有不良影响。

以上分析表明，高剂量四环素对大鼠具有生殖毒性作用，低剂量对大鼠生殖功能无显著影响，四环素的生殖毒性具有明显的“剂量依赖关系”，与软件预测结果契合度较低。

2.6 肝脏毒性预测结果和文献数据比较

软件判定满足以下两个条件之一，则预测可能引起肝毒性。条件一：ALT和AST同时升高。条件二：AST和ALT至少有一个升高且ALP、GGT、LDH至少有一个升高。

软件输出四环素肝脏潜在毒性结果为“ALT、AST和GGT升高，AlkPhos和LDH保持不变”，预测结果显示，四环素具有潜在的肝脏毒性。

大量研究发现，连续多天进行高剂量四环素[200 mg/(kg·d)]给药，大鼠和小鼠AST、ALT显著升高。对肝脏进行组织病变分析显示，该剂量下的大鼠以及小鼠肝脏病变明显，出现如广泛空泡变性、肝细胞脂肪变性以及淋巴细胞和中性粒细胞浸润等病理变化。提示该剂量的四环素具有肝脏毒性，可引起肝脏损伤。同时测定肝毒性标志物——氧化应激蛋白的表达情况，进一步证实高剂量四环素对大鼠具有肝毒性。低剂量四环素[50 mg/(kg·d)]处理后的小鼠仅见ALT显著升高，且肝脏无明显病变。且高剂量的四环素[200 mg/(kg·d)]处理24 h即可引起大鼠肝脏的脂肪病变，并引起肝细胞的局部炎症细胞浸润，但ALT和AST并没有显著的变化。

以上结果提示四环素具有肝脏毒性，且具有明显“时间和剂量依赖性”，与软件预测结果基本一致。

3 讨论

传统毒理学实验时间长，耗资大，而且需要进行动物实验，对动物伤害较大，因此急需建立快速和低成本的替代方法。随着计算机辅助药物设计技术的兴起，一些直观、形象并且准确度较高的商业软件上市。史少泽等分别用ADMET Predictor与VirtualToxLab两种软件预测中药成分的毒性。并对两种软件的准确度进行了比较，结果显示，ADMET Predictor在急性毒性以及肝毒性预测方面表现较好。关于该模型用于药物的毒性预测已有较多的报道，但尚未见其应用于四环素的毒性评估研究。因此，本文选用基于QSAR模型的ADMET Predictor软件进行四环素的毒性预测。

采用QSAR模型预测化合物的毒性研究报道较多，但该模型用于抗生素的毒性作用预测研究较少。如Huang等建立了QSAR模型用于中药活性成分肝毒性的筛选，得出该模型可用于中药活性成分肝毒性评价的补充工具的结论。Pavel等以梨状四膜虫的生长抑制为毒性判定依据，选择毒性数据集，建立QSAR模型进行毒性预测，发现该模型可用于梨状四膜虫的毒性筛选。Liu等建立四个QSAR模型，以斑马鱼为模型生物，预测有机污染物的毒性，该模型可有效地预测各种有机物对斑马鱼的胚胎毒性，有助于评估有机污染物对水生环境的潜在危害。

武英豪和蒋慧等使用ADMET Predictor分别对培氟沙星以及喹烯酮的毒性进行了预测，并与文献数据进行比较研究，但其中并未涉及对应药物肝脏毒性。由于抗生素引起的肝损伤在药物性肝毒中占有一定比例，同时有大量的文献对四环素的肝脏毒性进行了探究，因此本文在此基础上对四环素肝脏潜在毒性进行了预测并进行比较分析。软件预测四环素具有潜在肝脏毒性，文献数据显示，四环素具有肝脏毒性，且四环素引起肝脏毒性具有时间和剂量依赖性，预测结果和报道基本一致。

四环素致突变性、致癌性和致染色体变异性的预测结果与文献报道数据保持一致，其中急性毒性方面，软件以LC50作为毒性终点，文献报道多以LD50来判定急性毒性，两者在四环素急性毒性定性判断上相符，但无法进行定量比较。软件预测四环素没有生殖毒性，文献结果显示高剂量四环素具有生殖毒性，具有明显的“剂量依赖性”，和软件契合度较低。造成这种差异可能的原因是，QSAR模型依据药物结构特征来进行药物毒性的预测，而除了结构外其他影响药物理化性质的特征条件可能对药物的生殖毒性有影响，且实验条件以及精度也会对毒性研究结果产生影响。

以上比较分析结果说明，采用数据库数据建立的结构-毒效关系模型在药物毒性预测中具有较高的准确度。由于药物毒性数据库处于不断更新的状态，在实验数据缺乏时，软件预测可以为传统毒理学试验提供前期数据支持，但不能完全代替传统毒理学试验方法，这些预测软件可以用于药物的早期毒性效应评价及新药早期筛选。

4 结论

本文对四环素的急性毒性、致突变性、致染色体变异性、致癌性、生殖毒性及潜在肝脏毒性进行了预测，并与文献数据进行比较综合分析。结果显示，四环素具有致染色体变异性以及潜在肝脏毒性，不具有致突变性和致癌性且急性毒性较低，以上预测结果与实验数据基本保持一致。软件预测四环素不具有生殖毒性，文献数据显示，四环素高剂量时具有生殖毒性，预测结果与报道结果契合度较低。

（参考文献33篇，扫码关注获取）