酶法辅助提取柚皮多糖工艺条件的优化探究

梁昌祥，林云晓，陈兵兵

（贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州 542899）

柚子又名“文旦”，是芸香料植物柚柑橘属的成熟果实，果皮厚，果实鲜甜可口，有沙田柚、蜜柚、胡柚、葡萄柚、龙都早山柚和枰山柚等品种[1]，柚子在秋季成熟，一般在10—11 月成熟可采摘上市，果皮厚耐贮藏，因而获得“天然水果罐头”的称号。柚皮内富含营养元素，如磷钾元素，是对植物生长有利的营养元素，可作为植物的优质肥料，而且柚子皮内还富含化合物，如多糖、挥发油、维生素、黄酮类、粗纤维、香豆素类、天然色素、柚皮甙等化合物成分。柚皮成分中的多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，多糖具有抗菌、抗病毒、抗衰老、降血脂等药理作用，以及副作用小、不易造成残留等优点，相关研究人员把开发多糖资源、深入研究保健功能等的推进作为研究热点和焦点[2]。在国内外食品、药品、化妆品等领域研究是热点。

柚子树在我国栽培不仅历史悠久，而且品种资源丰富。起源于东南亚、印度北部或中国南部一带[3]，我国现在栽种柚类果树原产地众多，贵州、重庆、浙江、江西、广东、广西、福建、湖南、四川、湖北等省份较多。我国柚类水果每年产量和销量都较大，2017 年国内消费增加4%，约达到了460 万t。其中，中国柚类的种植面积和产量均居世界首位[4]。福建柚类种植面积、产量、出口量、市场份额等名列全国第一[5]，有“中国柚都”的美称。柚子经过工厂加工和人们食用后，产生大量的柚子皮一般会被当作垃圾处理，资源既得不到充分利用，又没有经济效益，还会发生污染环境等一系列问题。因此，如果这些柚子皮得以利用，实现变废为宝，对经济及环境有重大作用。例如，柚子皮具有多孔结构，可以吸附有毒有害物质，可用于废水处理等工序；柚子皮内含有许多生理活性物质，这些生理活性物质有抑菌、抗辐射、预防心脏病、预防脑血管疾病等作用，在发展制药和保健品方面的市场前景十分广阔；柚子皮含有一些维生素、矿物质、葡萄糖、铁、钙等营养成分，可以直接加工成食品。柚皮还具有保护心血管、驱虫、去角质、治小儿肺炎、治疗冻疮、去污去异味等作用，具有很大发展空间。

国内关于从柚皮中提取多糖的相关论文非常少。刘国聪等人[6]经2 h 回流脱脂，在高温90 ℃条件下提取3 h，最后得到柚皮多糖的平均产率为7.28%，虽然提取率不低，但回流时间长、效率低。郭文等人[1]采用热水浸提的方法提取柚皮多糖，最佳条件下柚皮多糖的提取率为6.45%，在经过2.5 h 的提取、提取2 次，但此最佳条件需要的时间长次数多且产率和效率都不高。孔梦晓等人[7]用水提醇沉法从柚皮中提取粗多糖，最佳提取条件下粗多糖平均提取率为8.14%，要经2.5 h 提取，再经3 次反复提取，此提取条件需要耗费的时间较长，且需要多次的反复提取，耗能耗时。岳贤田[2]和张荔菲等人[8]分别采用微波辅助、超声波酶法辅助提取多糖，前者浸提时间要4 h，且需浸提4 次；后者要酶解时间1.2 h，超声时间29 min，虽提取率较高，但是提取效率较低、成本较高。杨喆茗等人[9]用纤维素酶辅助提取柚皮多糖，反应时间为5.5h，提取3 次得率仅为6.3%，不仅提取时间长而且效率低。多糖是一类重要的大分子物质，主要广泛来源于高等植物，对人体的毒副作用小，免疫调节剂将具有很大的开发潜力，并且将多糖开发为新型抗肿瘤药物也具有较高的潜在价值[10]。现在心血管疾病的致死率高且治疗费惊人，肿瘤成为多发病、常见病，多糖在医药方面有很大的发展潜力。国内目前主要采用传统的溶剂提取法提取柚皮多糖[5]，近年来用酶法提取、微波辅助法、超声波辅助法等提取柚皮多糖，虽然能够在一定程度提高产率，但在优化提取条件方面有待提升。试验以柚子皮作为原料，经切片烘干后粉碎，过一定目筛，加酶辅助提取后滤液蒸发浓缩，加醇沉淀得到多糖。以柚子皮多糖提取率为指标，并采用分光光度计法测定柚子皮中的多糖提取率，研究分析4 个单因素酶用量、提取温度、反应时间、浓缩液与乙醇用量比对柚子皮多糖提取率的影响作用。先对各个单因素进行试验，再根据单因素试验结果设计正交试验方案对工艺提取条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

柚子皮，取黄色椭圆形柚子皮，厚度0.8~1.5 cm。

1.1.2 试剂

葡萄糖（AR），广东光华科技股份有限公司提供；果胶酶（酶活力5 万U/g）、纤维素酶（酶活力10 万U/g），宁夏和氏璧生物科技有限公司提供；硫酸（AR），西陇科学股份有限公司提供；95%乙醇（AR），成都市科龙化工试剂厂提供；10%苯酚。

1.2 仪器与设备

FZ102 型粉碎机，河北省黄马华市新兴电器厂产品；DHG-9240A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司产品；AR224CN 型电子分析天平，上海舜宇科学仪器有限公司产品；JJ500 型电子天平，江苏常熟徐市产品；HWS-26 型电热恒温水浴锅，上海—恒科学仪器有限公司产品；722 型可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；SHZ-D（Ⅲ） 型循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司产品。

1.3 柚子皮提取多糖的流程及测定方法

1.3.1 提取多糖的工艺步骤

从柚子皮中提取多糖的工艺流程：

柚子皮→80 ℃下烘干→粉碎→过40 目筛→称质量→移入锥形瓶→加蒸馏水→加酶→水浴提取→真空抽滤→取滤液蒸发浓缩至1/5→加95%乙醇沉淀→过滤收集沉淀→干燥箱70 ℃下烘干→得到粗多糖。

1.3.2 提取多糖的具体方法流程

参照相关文献[8-9]有所改动，将柚子剥皮，把柚子皮切成1 cm 宽的薄片放进80 ℃鼓风干燥箱中约烘干3 h，再用粉碎机粉碎，过40 目筛，准确称取5 g 柚皮粉倒入250 mL 锥形瓶中，再加入果胶酶和纤维素酶（按质量1∶1），再加蒸馏水至150 mL刻度，搅拌摇匀，pH 值5.5~5.8，在一定温度恒温水浴中浸提一定时间后过滤，浸提过程中适当搅拌，避免柚皮粉渣粘在瓶壁，其滤液蒸发浓缩至体积的1/5，浓缩液冷却后缓慢加入一定体积的95%乙醇，边加入边搅拌，静置3 h 后抽滤收集沉淀，将沉淀放置干燥箱中70 ℃烘干得到粗多糖。

1.3.3 粗多糖的提取率计算

1.3.4 绘制葡萄糖含量标准曲线

参考相关文献的硫酸-苯酚法[11-13]，方法步骤如下。

绘制标准曲线的步骤和方法见表1。

表1 绘制标准曲线的步骤和方法

1.4 单因素试验设计

参考相关文献[14-15]，采用酶辅助水提醇沉法，影响柚皮提取多糖的因素有很多，如酶添加量、浸提时间、提取温度、料液比、pH 值、乙醇用量等。通过预试验确定影响提取效果较大的因素，故选用酶添加量、提取时间、提取温度、浓缩液与乙醇用量比作为探究柚子皮提取粗多糖的单因素条件。

1.4.1 不同酶添加量对柚皮多糖提取率的影响

称取5 g 柚皮粉，保持固定的提取时间为80 min，温度50 ℃，浓缩液加入95%乙醇60 mL，酶添加量（果胶酶∶纤维素酶= 1∶1） 分别为1%，2%，3%，4%，5%进行提取试验，分别重复3 次。

1.4.2 不同提取时间对柚皮多糖提取率的影响

称取5 g 柚皮粉，保持固定加入的酶添加量3%，水浴提取温度50 ℃，浓缩液加入95%乙醇60 mL，提取时间分别取40，60，80，100，120 min 进行试验，分别重复3 次。

1.4.3 不同提取温度对柚皮多糖提取率的影响

称取5 g 柚皮粉，保持固定酶添加量3%，提取时间为80 min，浓缩液加入95%乙醇60 mL，提取温度分别为30，40，50，60，70 ℃进行试验，分别重复3 次。

1.4.4 不同浓缩液与乙醇用量比对柚皮多糖提取率的影响

称取5 g 柚皮粉，保持固定加入的酶添加量3%，温度50 ℃，提取时间为80 min，25 mL 浓缩液与加入95%乙醇比例分别为5∶4，5∶8，5∶12，5∶16，5∶20 （即乙醇用量分别为 20，40，60，80，100 mL）进行试验，分别重复3 次。

1.5 柚子皮多糖工艺提取条件的优化

1.5.1 设计正交试验

从每个单因素的研究范围内选择合适的3 个水平设计因素水平表，选取合适的正交表按编号进行试验，寻求最优水平搭配。

1.5.2 正交试验最佳条件的验证

通过正交表的试验结果分析得到提取多糖的最优水平组合，结合实际，用最佳提取工艺条件进行验证试验，重复3 次，检查预测值与试验值之间的差异。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖含量标准曲线回归方程

由试验得出的结果以葡萄糖质量浓度为横坐标（X），吸光度（Y） 为纵坐标绘制标准曲线。

柚皮粗多糖标准曲线见图1。

图1 柚皮粗多糖标准曲线

经计算得到葡萄糖含量标准曲线回归方程和相关系数为：

式中：A——吸光度；

C——标准溶液质量浓度，mg/mL。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 不同酶添加量对柚皮多糖提取率的影响

酶添加量对提取率的影响见图2。

图2 酶添加量对提取率的影响

由图2 可知，酶添加量（纤维素酶和果胶酶）为2%~3%时，可明显提高多糖提取率，当酶添加量到达3%时，多糖提取率升高趋势变得缓慢，也没有下降趋势，由于纤维素酶和果胶酶对植物细胞去除细胞壁起到很好的作用，所以加快细胞内多糖的流出，当酶添加量在3%~5%时，提取率无明显变化，可能因为多糖在3%时已基本全部提取出来，避免生产应用中成本的增加，应尽可能节省试剂用量。因此，选取2%，3%，4%酶含量进行正交试验。

2.2.2 不同提取时间对柚皮多糖提取率的影响

提取时间对提取率的影响见图3。

由图3 可知，提取时间分别为40，120 min 时提取率很低，提取时间从40~60 min 提取率显著升高，100 min 后多糖提取率明显下跌，可能加热时间太长会使多糖发生水解，如果时间过短，反应不完全也会使提取率过低，60~100 min 区间内提取率都较高，说明浸提时间加长在一定时间内是有利于多糖溶出，综合考虑选提取时间为60，80，100 min 进行正交试验。

图3 提取时间对提取率的影响

2.2.3 不同提取温度对柚皮多糖提取率的影响

提取温度对提取率的影响见图4。

图4 提取温度对提取率的影响

由图4 可知，50，60 ℃时趋势线平缓，提取结果相差微小，温度在45 ℃左右出现峰值，提取效果最好。纤维素酶和果胶酶的酶活性为50 ℃时最佳，温度在30，70 ℃时多糖提取效果都较低，因为温度过高或过低酶活性都会下降，影响反应速率，所以提取效果会下降。因此，选取提取温度为40，50，60 ℃进行正交试验。

2.2.4 不同浓缩液与乙醇用量比对柚皮多糖提取率的影响

乙醇用量对提取率的影响见图5。

图5 乙醇用量对提取率的影响

由图5 可知，25 mL 浓缩液所加的乙醇用量为40 mL（浓缩液与乙醇用量比5∶8） 时提取率最高，以此为中心点加入过多或过少的95%乙醇都对多糖的沉淀量有较大影响，乙醇用量为40 mL（浓缩液与乙醇量比5∶8） 时可能多糖已全部发生沉淀，且要考虑到实际生产中加入过多95%乙醇会造成成本的增加，故选取浓缩液与加乙醇用量比分别为5∶4，5∶8，5∶12 （即加乙醇分别为 20，40，60 mL） 作为进行正交试验的因素水平。

2.3 正交试验结果与分析

2.3.1 正交试验因素水平表

根据单因素的试验结果分析，从每个单因素中选择合适的3 个水平，设计合理的四因素三水平的试验方案，并列出L9（34）正交表。

正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计

2.3.2 正交试验设计与结果

正交表和试验分析结果见表3。

表3 正交表和试验分析结果

由直观分析可知，RC>RA>RB>RD，4 个影响多糖提取效果的因素按影响作用大小排序分别是C>A>B>D，因此可进行的排列顺序如下：提取温度>酶添加量>提取时间> 浓缩液与乙醇用量比，提取温度最显著，根据实际生产中提取效率和提取率的考虑，最优组合为A2B1C1D2，即酶添加量为3%，提取时间为60 min，提取温度40 ℃，浓缩液与乙醇用量比为5∶8（加乙醇量40 mL） 时多糖提取率最高。

2.3.3 最优条件的优化

通过研究分析单因素试验和进行正交试验后的数据得到最优组合，再依据最优水平组合进行3 次重复试验，验证试验结果第1 次为7.6%，第2 次为9.0%，第3 次为8.0%，平均提取率为8.2%，大于正交试验中的最大值，验证试验成功。

95%乙醇沉淀见图6，烘干的粗多糖见图7。

图6 95%乙醇沉淀

图7 烘干的粗多糖

3 结论

通过进行酶添加量、提取时间、提取温度、浓缩液与乙醇用量比的单因素试验分析，并合理设计正交试验方案，对数据进行科学处理分析得到最佳的工艺条件为酶添加量3%，提取时间60 min，提取温度40 ℃，浓缩液与乙醇用量比5∶8（加乙醇用量40 mL） 时多糖提取率为8.2%。测出的提取率大于正交试验中的最大值，实现了最佳条件优化。细胞壁中的纤维素和果胶会在纤维素酶和果胶酶作用下酶解，加快细胞壁破裂，有利于多糖的溶出。酶法辅助提取比传统水溶性、热水浸提缩短提取时间和降低提取温度，便于在实际生产中成本的节省和效率的提高，并且工艺简便、经济环保无毒。试验过程中产生的柚皮渣可充分利用起来，可在发酵原料、饲料等方面的用途发展，其开发潜力都有待进一步的研究。