垫状卷柏提取物对人白血病细胞K562诱导凋亡的研究

张应

近年来药理学研究表明垫状卷柏具有多种药理学活性，其中抗肿瘤活性具有特异性得到关注和重视[1-3]。本课题组前期对垫状卷柏提取物(Selaginelpulvinate extracts，SP) 的抗肿瘤活性进行系统性的筛选，发现SP对人白血病细胞系K562的体外细胞增生抑制作用最强，为进一步研究其作用机制，笔者开展了SP对K562肿瘤细胞作用机制的研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及药材 K562肿瘤细胞由中国科学院基础医学研究院细胞库提供。垫状卷柏购于安徽亳州滕王药业有限公司，批号为1907003，为全草干燥状态。

1.2 试剂 RPMI-1640培养液(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；膜联蛋白V/碘化吡啶(Annexin V/PI)试剂盒(BD)；灭菌胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；无水乙醇(国药化试)。

1.3 仪器 超声波清洗仪(KQ-500，昆山市超声仪器有限公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermofisher公司)；生物安全柜(美国LABCONCO公司)；CKX41型倒置光学显微镜(Olympus公司)；FACsc-alibur型流式细胞仪(Beeton-Diekinson公司)；台式离心机(Anke TDL-40型，上海安亭科学仪器厂)；压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KB，安海申安医疗器械厂)。

1.4 SP的制备 称取适量垫状卷柏干燥的全草，粉碎过40目筛备用。称取100 g状卷柏干燥全草粉末，以75%乙醇作为提取溶剂(料液比1∶20)，浸提24 h后，超声提取20 min，提取温度40 ℃，真空抽滤后滤渣重复上操作2次，最后合并滤液，旋蒸浓缩后并减压干燥成干粉。实验临用前用75%乙醇溶解得到高浓度的母液，0.22 μm滤膜过除滤后待用，给药时用PBS溶液稀释至所需的浓度。最高给药浓度组所用的药液中乙醇浓度均小于0.3%，预实验表明含0.3%乙醇的PBS组与PBS空白组相比较，对本研究所涉及肿瘤细胞株的吸光度均差异无统计学意义(P＞0.05)，说明含0.3%乙醇的PBS对本研究中所有肿瘤细胞株的增生无影响。

1.5 SP对肿瘤细胞凋亡的检测 取对数生长期的人慢性髓系K562肿瘤细胞，重悬后以5×105个/mL浓度接种于6孔板中培养24 h后吸弃原培养液，加入90 μL新鲜培养液和10 μL 不同浓度的SP 溶液，每组设3个复孔并另设PBS空白对照组。继续培养36 h后，收集各组细胞，用PBS洗涤2次，悬于结合缓冲液中，调整细胞浓度至1×106个/mL；先加入5 μL Annexin V试剂，混合均匀，然后再加入5 μL PI试剂，混合均匀，孵育15 min后用流式细胞仪进行检测。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件统计分析。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP对K562肿瘤细胞凋亡的影响 与PBS空白对照组相比较，不同浓度组SP作用于K562细胞36 h 后细胞凋亡率均有不同程度的增加，其中50 μg/mL和100 μg/mL浓度组的差异有统计学意义(P＜0.05)；不同浓度组的凋亡情况存在良好的剂量相关性：以SP浓度为纵坐标，K562细胞凋亡率为横坐标，回归直线方程的r值为99%。结果表明SP能有效诱导K562细胞凋亡，见表1、图1。

图1 细胞凋亡图

表1 SP对K562细胞肿瘤凋亡的影响(±s)

表1 SP对K562细胞肿瘤凋亡的影响(±s)

注：与PBS空白对照组比较，*P＜0.05。

组别 凋亡率(%)PBS空白对照组 1.01±0.15 SP给药组5 μg/mL 25 μg/mL 2.36±0.72 4.04±0.29 50 μg/mL 10.92±0.21*100 μg/mL 24.73±0.38*

3 讨论

卷柏属植物作为民间传统草药被用于肿瘤方面的治疗，其中卷柏属植物中的垫状卷柏被中国药典收录，主治经闭痛经，跌打损伤等症，其成分较为复杂，主要有双黄酮类、炔酚类、苯丙素类、生物碱类等[4-5]。

本课题组前期对SP在不同系列肿瘤细胞系的增生活性进行筛选，发现对人白血病细胞系的敏感性最高，因此在笔者选取对SP敏感性最高的K562肿瘤细胞进行进一步研究，发现能有效诱导肿瘤细胞的凋亡。近年来有文献报道[1-2，6-10]，SP能通过诱导细胞凋亡而产生抑制肿瘤增生作用的，其机制可能是Caspase途径的激活从而导致Bcl-2表达减弱有一定关系，有研究表明[11-15]SP对Bax mRNA表达有明显上调作用，Bcl-2 mRNA表达存在明显下调作用，从而抑制Bcl-2表达，且有剂量依赖性，进而诱导细胞的凋亡。本研究也证实SP抗肿瘤活性的可能机制是促进细胞凋亡，但具体分子生物学机制仍需进一步的研究和探讨。

综上所述，SP通过诱导K562肿瘤细胞凋亡，从而实现其抗肿瘤的目的。