纳豆激酶对大鼠脑血栓的溶栓作用研究

2021-08-07郑立娟陈小婕杨岩史新龙吴焘张生琰

中国疗养医学 2021年9期

郑立娟陈小婕杨岩史新龙吴焘张生琰

纳豆激酶(NK)是一种纳豆菌在发酵过程中由枯草芽孢杆菌分泌生成的具有高效溶栓效果的纤维蛋白酶，具有抗血栓、抗菌、抗氧化、降血压、降血脂等多种作用[1]。目前，临床常见的急性心肌梗死、脑血栓中风、脉管栓塞等多种严重的心血管疾病均由血栓引发，这些疾病好发于中老年人群，对中老年患者的身体健康构成极大的威胁[2]。据报道，全球范围内目前有1 500万以上的血栓患者，溶栓剂的潜在市场值达20亿美元之多[3]。然而临床上常用的链激酶、尿激酶、重组组织型纤溶酶原激活物等溶栓剂均存在价格昂贵、副作用大、半衰期短等缺点，制约了在临床上的广泛应用。NK具有溶栓效果好、起效快、体内半衰期长、安全性好、成本低等优点，有用于开发新型溶栓剂的潜力[4]。NK溶栓作用有几种不同的给药方式，各自有各自的优点[5]。本实验探讨通过十二指肠给药的途径应用NK对大鼠脑血栓的溶栓作用，结果如下。

1 实验材料

1.1 动物 wistar大鼠，雄性，体质量360～450 g。

1.2 仪器 ①医用牙科钻。②漩涡混合器，型号：QL-901，由上海市麒麟医用仪器厂生产。③振荡培养箱，型号：SPX-250B-D型，由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产。

1.3 药物试剂 ①纳豆激酶冻干粉(NK酶粉)，由北京孚曼生物技术有限公司提供，比活性：275 FU/mg，批号：20110321，HPLC纯度：83.66%，蛋白含量：24.4%(其余为NaCl)。保存方法：-20 ℃密封保存。②戊巴比妥钠，规格：25 g，产品批号：F20030816，中国医药(集团)上海化学试剂公司。③聚山梨酯80(吐温80)，规格：500 g，批号：101212M，为上海申宇医药化工有限公司产品。④大豆油(药用级)，规格：1 L，批号：09050101，由铁岭北亚药用油有限公司提供。⑤红四氮唑(TTC)，规格：10 g，批号：2010512，为上海中秦化学试剂有限公司产品。

2 实验方法

2.1 实验药物的配法 ①50%FeCl3溶液的配制。36.5%的HCl 1 mL，加于9 mL双蒸水得到1 mmol/L的HCl 10 mL。称取FeCl35g，将FeCl3溶于1 mmol/L的10 mL HCl中，即得到50% FeCl3溶液。FeCl3·6H2O规格：500 g，批号：100325，为天津市光复科技发展有限公司产品。36.5% HCl规格：500 mL，批号：100302，为白银市良友化学试剂公司产品。②2%红四氮唑(TTC)的配制。0.2 M pH 7.6的PBS缓冲液20 mL，加入TTC 0.4 g。TTC避光保存，临用前配制。③0.3%戊巴比妥钠的配制。称取0.3 g的戊巴比妥钠，溶于100 mL生理盐水即可。④溶媒配制。取46.5 mL大豆油(药用级)与3.5 mL聚山梨酯80混匀即可，其中聚山梨酯80浓度为7.0%(V/V)。⑤纳豆激酶油溶液配制。称取145.6 mg纳豆激酶冻干粉，加溶媒到10 mL后混匀，即得纳豆激酶油溶液(4 000 FU/mL)。每只大鼠体质量约400 g，每只给NK油溶液1 mL，含药4 000 FU。

2.2 实验动物分组将24只wistar大鼠按体质量随机分为两组：模型对照组和NK组，每组各12只。2.3 给药方案模型对照组：给等容量溶媒(2.5 mL/kg)，同时给生理盐水2.5 mL/kg。NK 组：10 000 U/kg(2.5 mL/kg，4 000 FU/mL，14.56 mg/mL)，同时给生理盐水2.5 mL/kg。

2.4 模型制备方法[6]用0.3%戊巴比妥钠按1 mL/100 g腹腔内注射，麻醉后右侧位固定，沿左眼外眦与外耳道连线的中点做一长约2 cm的垂直切口，钝性分离颧肌，咬去颧弓，撑开下颌关节，在颧弓根部前下方0.2 cm处用牙科钻打薄骨质，牙科探针挑去骨片，开一约4 mm×3 mm的骨窗，可见大脑中动脉(MCA)沿嗅束垂直方向走行。取长约3 mm浸于50% FeCl3溶液的1号线，帖于MCA中段(位于嗅束与大脑中静脉之间)，每次帖线7.5 min，共四次，30 min。最后，生理盐水冲洗创面，依次缝合组织、皮肤。

2.5 给药方法大鼠在MCA血栓形成术后立即经十二指肠给药一次，观察药物的治疗作用。

2.6 神经症状的评分标准[7]术后24 h按神经学评分标准来评价神经功能。神经学评分标准为：总分11分；尾部倒提时，患侧上肢内收，评为2分；肩外旋，评为2分；向对侧推左(右)上肢，患侧抵抗力下降，评为1～3分；将上肢置金属网上，患侧肢肌张力下降，评为1～3分；向患侧旋转，评为1分。

2.7 染色方法及脑梗死面积的计算术后24 h将大鼠断头处死，取出大脑组织，置于-20 ℃冰箱15 min，待其冻硬后，用刀片将大脑沿冠状面切成5片，置于2% TTC溶液中，37℃孵育30 min。取出脑片，按组织学顺序铺平后拍照，用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统软件计算梗死灶面积。

2.8 脑含水量的计算拍照后分别称取左、右侧(患侧和正常侧)大脑湿重，置于60 ℃温箱72 h，烘干至恒重，称干重计算两侧脑含水量。脑含水量(%)＝(湿重-干重)/湿重×100%。

2.9 统计学处理采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 两组大鼠脑片染色后图片治疗后，NK组脑切片中下部白色梗死区域面积明显小于模型对照组，见图1～2。

图1 模型对照组

图2 NK组

3.2 NK对FeCl3诱导大鼠MCA血栓形成脑梗死面积的影响比较与模型对照组相比，NK组的脑梗死面积和神经系统症状评分均明显偏小，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。3.3 NK对FeCl3诱导大鼠MCA血栓形成术后脑含水量的影响比较模型对照组和NK组的患侧脑含水量均明显高于正常侧脑含水量，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；模型对照组和NK组的患侧脑含水量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表1 NK对FeCl3诱导大鼠MCA血栓形成脑梗死面积的影响比较(±s)

?组别例数梗死面积(%) 神经系统症状评分(分)模型对照组 12 6.67±1.02 7.17±1.40 NK组 12 5.45±0.78 5.92±1.01 t值 3.291 2.508 P值 0.002 0.010

表2 NK对FeCl3诱导大鼠MCA血栓形成术后脑含水量的影响比较(±s) 单位：%

组别例数患侧脑含水量正常侧脑含水量 t配对值 P值模型对照组 12 76.73±1.10 75.49±0.95 2.955 0.004 NK组 12 76.27±0.85 75.17±1.19 2.606 0.008 t值 1.146 0.728 P值 0.132 0.237

4 讨论

近年来，血栓症已逐渐成为死亡率居于首位的疾病，严重威胁中老年人群的身体健康[8]。应用溶栓药物来溶解血栓是治疗血栓症的主要手段。尿激酶、链激酶等属于第一代溶栓药物，对纤维蛋白无特异性的选择作用，因此有半衰期短、出血倾向等缺点[9]。重组单链尿激酶、葡激酶、链激酶复合物、组织型纤溶酶原激活剂等属于第二代溶栓药物，其纤溶作用强于第一代药物，然而仍然存在半衰期短、纤维蛋白特异性低、要求大剂量持续用药、成本高等缺点[10]。基于此，研发新型有效的溶栓药物具有重要的临床意义。NK是能够直接溶解纤维蛋白的一种纤溶酶，近年来成为溶栓药物关注的焦点[11]。NK于1987年由Sumi等日本学者首次发现，通过纳豆发酵所得，能够明显的溶解体外血栓，缩短优球蛋白的溶解时间，有潜力成为新型的溶栓药物[12]。本研究探讨通过十二指肠给药的途径应用NK对大鼠脑血栓的溶栓作用，以期为NK在临床上应用于抗血栓治疗提供实验依据。

本研究结果显示，与模型对照组相比，NK组的脑梗死面积和神经症状24 h评分均明显偏小，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。提示NK经十二指肠给药能够明显减小大鼠脑梗死面积，改善神经系统损伤。研究表明，NK从以下四个方面发挥溶栓作用：①溶解纤维蛋白，从而直接溶解血栓。②改善尿激酶原的空间结构，从而激活尿激酶，发挥溶解血栓的作用。③刺激tPA的生成来溶解血栓。④降解纤维酶原激活剂的抑制剂来间接溶解血栓[13]。有文献报道[14]，机体有独立的转运系统来转运蛋白质的消化产物-小肽，且其转运效率与小肽转运蛋白(PepT1)在肠道中的分布密切相关，而十二指肠中PepT1广泛分布。研究认为，十二指肠中的肽酶能够将NK水解为9个小肽，从而有利于小肠全段对NK的充分吸收[15]。另外本研究结果显示，模型对照组和NK组的患侧脑含水量均明显高于正常侧脑含水量，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；模型对照组和NK组的患侧脑含水量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。这可能是由于FeCl3和HCl的化学刺激导致两组大鼠脑组织充血水肿甚至坏死，在术后24 h取脑时，发现两组均有大鼠患侧脑组织缺损，这直接导致患侧脑含水量数值较正常侧高。此外在本实验实施的过程中发现，NK在含7.0%的吐温80的大豆油中的溶解性不好，这会导致给药过程中部分药物丢失的风险，因此在后续的研究中需要探索新的溶媒来溶解NK，以提高给药的准确性。

综上所述，NK经十二指肠给药能够明显减小大鼠脑梗死面积，改善神经系统损伤。