IVF-ET反复种植失败患者子宫内膜中miR-155、miR-21表达

习艳霞 王慧春 刘慧文

北京市海淀区妇幼保健院(100088)

不孕症影响10%的育龄夫妇[1]。体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术已成为治疗不孕症最有效的方法，但总体妊娠率仍只有30%～40%[2]。一些不孕患者甚至出现反复种植失败(RIF)，是IVF治疗中的一个严重问题[3]。RIF的发生受多种因素影响，其中子宫内膜容受性是胚胎种植成功的先决条件[4]。微小RNA(miRNA)在各种细胞生理病理过程中起重要调节作用。miR-155被编码在B细胞整合簇中，在抗原刺激机体时，巨噬细胞和树突状细胞(DC)会诱导其高水平表达[5]。一项回顾性分析RIF患者子宫内膜样本中miRNA差异表达的miRNA图谱时发现，miR-155-5p与RIF有关[6]。miR-21是转录后水平上基因表达的调节因子，在包括子宫内膜癌在内的几乎所有实体瘤中均有高表达，因此被认为是一种致癌的miRNA转录的重要驱动子，在肿瘤和心血管疾病中表达上调[7]。研究发现，miR-21-5p功能丧失小家鼠植入小鼠的胚胎数量减少，可能与miR-21-5p功能丧失有关[8]。因此，本研究通过检测IVF-ET发生RIF的患者子宫内膜组织中的miR-155、miR-21水平，分析二者与RIF的关系，为临床降低RIF的发生提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月—2019年9月在本院生殖医学中心行优质胚胎移植失败≥3次(包括新鲜周期及解冻周期)患者40例(RIF组)，同期行IVF-ET成功妊娠患者40例为对照组。胚胎移植后30 d行B超检测到妊娠囊及原始心管搏动确定临床妊娠[9]。收集两组年龄、体质指数(BMI)、收缩压、舒张压、孕次、产次、人工流产史、自然流产史、RIF次数、不孕年限、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等一般资料。纳入标准：①婚后正常同居>1年，未采取避孕措施，男方精液正常，女方因输卵管梗阻行IVF-ET助孕；②月经规律，基础性腺激素正常水平；③既往无卵巢手术史，3个月内无激素治疗及宫腔操作史，无子宫内膜异位症病史；④病历资料完整。排除标准：①存在生殖器畸形、子宫内膜炎、子宫内膜息肉或多囊卵巢综合征；②垂体或甲状腺功能异常，影响性激素水平；③存在严重的心肺肾等器官的功能障碍；④合并免疫缺陷病、急慢性肝炎、恶性肿瘤。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 主要试剂与仪器

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(南京赛泓瑞生物科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP、600bp DNA ladder购自赛默飞世尔生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(杭州博日)；-80℃超低温冰箱(美国Thermo Scientific公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 研究方法

1.3.1子宫内膜组织样本的采集与保存患者均在IVF-ET前1月经周期排卵后1周即黄体中期采用一次性宫腔组织吸引管采集子宫内膜组织，-80℃保存备用。

1.3.2子宫内膜组织中miR-155、miR-21检测按照Trizol法提取受试者子宫内膜组织中总RNA，分光光度计测定总RNA纯度及浓度，根据逆转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex Taq TM 试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应，U6基因作为内参，miR-155、miR-21、U6引物序列见表1。反应条件为：95℃，10 min；40个PCR循环(95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，15 s)。采用2-ΔΔCt方法计算子宫内膜组织中miR-155、miR-21相对表达量。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3血清TNF-α、IL-6、IL-1β检测从-80℃冰箱中取出冻存血清样本解冻，ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，操作均严格按照仪器及试剂盒说明书进行。

1.3.4子宫内膜容受性检测于胚胎移植日采用阴道B超检测受试者子宫内膜容受性，观察子宫内膜螺旋动脉搏动指数(PI)、阻力指数(RI)及子宫内膜厚度(Em)指标。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

两组年龄、BMI、收缩压、舒张压、孕次、产次、人工流产史、自然流产史、不孕年限等均无差异(P>0.05)。见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2子宫内膜miR-155、miR-21水平比较

RIF组子宫内膜miR-155(3.18±1.15)、miR-21(2.51±0.82)水平高于对照组(1.02±0.18、1.06±0.16)(t=11.736、10.977，均P=0.000)。

2.3 血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较

RIF组血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较

2.4 子宫内膜容受性指标比较

与对照组相比，RIF组子宫内膜容受性指标PI、RI升高，Em降低(均P<0.05)。见表4。

表4 两组子宫内膜容受性指标比较

2.5RIF组子宫内膜miR-155、miR-21水平与炎症因子及子宫内膜容受性指标相关性

Pearson法分析显示，RIF组患者子宫内膜miR-155、miR-21水平与血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及PI、RI均呈正相关，与Em呈负相关(均P<0.05)。见表5。

表5 RIF组患者子宫内膜miR水平与炎症因子及子宫内膜容受性指标相关性

2.6 二元logistic回归分析RIF的影响因素

以患者是否发生RIF为因变量，以RIF患者子宫内膜组织中miR-155、miR-21水平、血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β水平及子宫内膜容受性指标PI、RI及Em为自变量，进行二元logistic回归分析。结果显示，TNF-α、IL-6、IL-1β、PI、RI及Em既不是危险因素也不是保护因素(P>0.05)；miR-155、miR-21是影响IVF-ET妇女发生RIF的危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 二元logistic回归分析RIF的影响因素

3 讨论

RIF是影响IVF-ET妊娠结局的重要因素之一，近年来受到越来越多关注，但目前RIF定义尚不统一，国内外比较公认的RIF定义是指经历3次及以上移植周期，且累积移植至少4枚卵裂期优质胚胎而未获得临床妊娠[3]。在IVF-ET过程中胚胎移植次数、所移植胚胎数量及质量、孕妇年龄等都与RIF有关。多种因素可能会导致RIF，包括双亲染色体异常、胚胎的遗传或代谢异常、子宫容受性差以及着床部位的免疫紊乱。一些妇科疾病，如子宫内膜异位症、子宫肌瘤、输卵管积水和子宫内膜息肉，也会对着床率产生负面影响。此外，吸烟、饮酒和肥胖，也可能会降低胚胎种植成功的可能性[10]。RIF的发生既可能由单个因素导致，也可能是多种因素综合影响所致，但迄今为止，RIF发生的相关机制尚不明确，因此探究RIF发生的相关影响因素十分重要。

miRNA通过靶向信使RNA(mRNA)调控基因和蛋白质的表达，这些小的非编码RNA可通过与靶mRNA的3'-UTR结合来降解、破坏或抑制mRNA的翻译[11]。miR-155最初被鉴定为B细胞整合簇基因[5]。由于miR-155具有免疫调节功能，而子宫内膜容受性和胎盘着床均需要免疫反应的特异性适应，一项针对孕周环境中miRNAs水平的研究发现，miR-155可通过抑制调节性T细胞水平等免疫细胞水平，进而赋予胚胎适应性免疫耐受[12]。miR-21在17q23.2中起癌基因的作用[13]。有研究显示，敲除miR-21-5p后的母猪影响程序性细胞死亡因子4/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1途径并破坏子宫内膜容受性，导致猪胚胎移植失败[8]。另有研究发现，miR-155、miR-21均参与炎症反应的调节，可促进TNF-α、IL-6等炎症因子的表达[14]。

金志春等[15]发现，血清中炎症水平过高可能会导致IVF-ET种植失败，通过针刺抑制IVF-ET患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，有助于提高IVF-ET妊娠成功率。根据上述研究推测，miR-155、miR-21与子宫内膜容受性及炎症水平的调节密切相关。本研究检测子宫内膜组织中相关指标，与对照组相比，RIF组子宫内膜组织中miR-155、miR-21、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高。提示miR-155、miR-21、TNF-α、IL-6、IL-1β水平可能与RIF有关，推测可能是miR-155、miR-21水平升高，上调了TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子水平，进而导致RIF。

子宫内膜容受性是IVF-ET成功的重要条件，有研究发现[16]在IVF-ET周期中，子宫内膜厚度与妊娠丢失及活产率密切相关。子宫螺旋动脉阻力升高及血流速度减慢可导致子宫内膜血流灌注量减少，子宫内膜容受性下降，不利于孕卵着床[17]。本研究进一步分析子宫内膜容受性发现，RIF组较对照组子宫内膜容受性指标PI、RI升高，Em降低。提示RIF患者存在子宫内膜容受性变化，可能与RIF的发生有关。贾启明等[18]发现miR-155、miR-21水平与TNF-α、IL-2、C反应蛋白等炎症因子呈正相关，miR-155、miR-21及炎症因子的增加可能是影响脓毒症合并心功能障碍患者预后的危险因素。本研究经Pearson法分析显示，RIF患者子宫内膜miR-155、miR-21水平与TNF-α、IL-6、IL-1β、PI、RI呈正相关，与Em呈负相关。提示RIF患者子宫内膜miR-155、miR-21水平与炎症反应和子宫内膜容受性密切相关，可能存在协同作用进而影响RIF的发生。本研究经logistic回归分析，TNF-α、IL-6、IL-1β、PI、RI及Em既不是发生RIF的危险因素也不是保护因素，而miR-155、miR-21是影响IVF-ET妇女发生RIF的危险因素，提示miR-155、miR-21与RIF的发生密切相关，可能作为潜在的预测RIF的标志物。

综上所述，RIF患者子宫内膜组织中miR-155、miR-21、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，子宫内膜容受性指标PI、RI升高、Em降低，miR-155、miR-21与子宫内膜炎症水平及子宫内膜容受性有关，可作为诊断RIF的指标。本研究也存在样本量小、未检测血清中miR-155、miR-21水平等不足，因此miR-155、miR-21与RIF的关系还有待深入探究。