固相萃取/超高效液相色谱－串联质谱法测定香辛调料中的曲托喹酚

张海超，王 敬，贾海涛，李 玮，艾连峰*，康维钧

（1．石家庄海关技术中心，河北 石家庄 050051；2．河北医科大学 公共卫生学院，河北 石家庄 050017）

曲托喹酚是一种天然的苄基异喹啉类生物碱（如图1），同时也是一种β2受体激动剂，具有罂粟碱的解痉作用，作用与沙丁胺醇相似，强度为异丙肾上腺素的5～10倍［1］，在临床上常被用作平喘药治疗支气管哮喘、哮喘样支气管炎。自2019年1月起，曲托喹酚被世界反兴奋剂机构列入了禁药名单。由于曲托喹酚存在于一些天然产物中［2］，极有可能被运动员误食而引发兴奋剂检测阳性事件。我国反兴奋剂中心在2019年8月印发的《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南（暂行）》的通知中也将曲托喹酚列入建议检测化合物清单，明确检测基质为香辛调料。因此，为杜绝食源性兴奋剂事件的发生，建立香辛调料中曲托喹酚的检测技术，对维护体育运动中的食品安全具有重要意义。

图1 曲托喹酚的分子结构式Fig．1 Formula structure of tretoquinol

目前关于曲托喹酚的检测研究报道极少，仅见Okano等［3］采用液相色谱－串联质谱法测定人体尿液中曲托喹酚的研究，关于植物源性食品中曲托喹酚的研究未见报道。液相色谱－串联质谱法具有灵敏度高、选择性好的优点，在其他β2受体激动剂检测技术上得到了广泛应用［4－11］。目前关于β2受体激动剂的前处理方式主要有QuEChERS法［4，6］和固相萃取法［7－10］。由于香辛调料成分复杂，含有挥发性油、有机酸、生物碱等多种醇、醛、酮、萜类化合物，采用QuEChERS法会存在净化不完全。并且有研究报道，PSA、GCB、C18、Florisil等QuEChERS法常用的固相吸附剂对与曲托喹酚性质类似的化合物去甲乌药碱有不同程度的吸附现象［5］。因此本研究结合曲托喹酚的理化性质，在对比两种固相萃取净化技术后，采用MCX柱净化，超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS/MS）测定了花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陈皮、栀子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香叶共18种常见香辛调料基质中的曲托喹酚。该方法简单、灵敏、普适性强，可为我国体育赛事食品安全保障工作和相关检测标准的制定提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC 8050超高效液相色谱－串联质谱仪（日本Shimadzu公司）；Sigma 3K－15型离心机（美国Sigma公司）；PT2100型均质器（瑞士Kinematica公司）；N－EVAP112氮吹仪（美国Organomation公司）；涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；Milli-Q纯水系统（美国Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）；Oasis MCX固相萃取柱、Oasis PRiME HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美国Waters公司）。

乙腈、甲醇、乙醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，德国Fluka公司）；水为Milli-Q高纯水；花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陈皮、栀子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香叶均从市场上随机抽取。

100μg/mL曲托喹酚（First Standard品牌标准品）购于天津阿尔塔科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

准确移取曲托喹酚标准品1 mL，用甲醇稀释，配置成质量浓度为1．0μg/mL的标准溶液，于-18℃下避光保存。在实验过程中根据需要精确吸取适量标准溶液用0．1%甲酸－乙腈（9∶1，体积比）稀释至所需质量浓度。

1.3 样品预处理

准确称取2 g样品（精确到0．01 g）于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 0．2%甲酸乙醇，于均质器上以10 000 r/min均质1 min。以10 000 r/min离心5 min，取适量上清液过滤膜待净化。

将MCX固相萃取柱分别采用3 mL甲醇和3 mL水活化，取上述2 mL上清液于固相萃取柱上，待样液流出，采用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 5%氨水甲醇洗脱，接收洗脱液于40℃下氮吹至干，用1 mL 0．1%甲酸－乙腈（9∶1）涡旋溶解残渣，过0．22μm有机滤膜后供UPLC－MS/MS测试。

1.4 仪器分析条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）；流动相：含0．1%甲酸的水溶液（A）和乙腈（B）；流速：0．4 mL/min；柱温：35℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：0～0．5 min，10%B；0．5～4 min，10%～90%B；4～5 min，90%B；5～5．01 min，90%～10%B；5．01～7 min，10%B。

质谱条件：电喷雾电离源ESI（+），采用多反应监测（MRM）模式。离子源温度为350℃，毛细管温度为250℃，加热模块温度为350℃，氮气流速：3．0 L/min，干燥气流速：10．0 L/min，加热气流速：10．0 L/min。MRM监测离子对的质荷比（m/z）分别为346．3、164．2和346．3、137．0，碰撞能量分别为19 eV和45 eV，Q1电压分别为15 V和15 V，Q3电压分别为15 V和25 V，其中m/z346．3、164．2为定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 提取溶液的选择

提取溶液的选择以提取更多的目标化合物和更少的杂质为目的。本研究以曲托喹酚的回收率和基质标准溶液的响应值作为判断标准，在空白样品中添加50μg/kg曲托喹酚标准溶液作为模拟样品进行考察。曲托喹酚属于一种苄基异喹啉类生物碱，其油水分配系数（logP）为2．23，解离常数（pKa）为9．53，水溶性较强，故采用酸性极性溶剂更有利于曲托喹酚的提取。本实验对比了0．2%甲酸乙醇、0．2%甲酸乙腈、0．2%甲酸水－甲醇（1∶9），0．2%甲酸水－甲醇（9∶1）4种提取溶剂的提取效果。结果显示，0．2%甲酸水－甲醇（9∶1）的提取回收率约70%，0．2%甲酸乙腈的提取回收率为80%～90%，0．2%甲酸乙醇和0．2%甲酸水－甲醇（1∶9）的提取回收率均在95%以上，且以0．2%甲酸乙醇的提取液响应值更高。

考虑到水和提取溶剂间极性的差异，样品中含水量的不同可能会影响曲托喹酚的提取效率，本实验对样品中含水量的影响进行了考察。以花椒基质样品为例，向样品中加适量水浸泡，模拟不同含水量的实际样品，并采用20 mL含0．2%甲酸的乙醇溶液进行提取，考察曲托喹酚的提取效率。结果表明，样品中含水量的上升会导致杂质提取较多，引起曲托喹酚提取率的降低，考虑到香辛调料一般为干样，故在提取过程中，选择不加水浸泡直接采用含0．2%甲酸的乙醇溶液提取。

2.2 固相萃取净化的选择

香辛调料基质的成分复杂多样，需采取固相萃取净化方式以降低背景干扰，减少基质效应。由于曲托喹酚在酸性条件下易形成阳离子。本研究对比了两种固相萃取柱Oasis MCX和Oasis PRiME HLB对花椒、辣椒、桂皮、孜然和小茴香5种基质的净化效果。结果表明采用PRiME HLB时，曲托喹酚的回收率为54%～125%，而采用MCX柱的回收率为71%～115%。且PRiME HLB固相萃取柱表现出更强的基质效应。分析原因可能是PRiME HLB含有特定比例的亲水基和疏水基，对生物碱和基质杂质均有一定保留能力，专属性差，不能有效去除基质干扰；而MCX柱为将磺酸基键合在高度交联的聚苯乙烯/二乙烯苯（PS/DVB）表面得到的混合型阳离子吸附剂，具有反相和强阳离子交换双重保留性能，对碱性物质有良好的选择性和灵敏度。因此，MCX柱对香辛调料中的曲托喹酚表现出了更优越的净化性能。

2.3 检测条件的优化

采用不接分析柱的方式向质谱系统注入1μL 1μg/mL标准溶液，在正离子模式下进行全扫描，确定分子离子峰，再以待测物分子离子峰为母离子，对其进行子离子扫描。选择两个特征离子164．2和137．2，然后优化出最佳碰撞能量CE和Q1、Q3电压，最终确定多反应监测的离子对及碰撞能量（见“1．4”）。

选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）对曲托喹酚进行分离，比较了流动相以0．1%甲酸水溶液或水作为水相（A）、甲醇或乙腈作为有机相（B）时的分离效果。结果表明，乙腈和甲醇对目标物的灵敏度影响不大，但乙腈作为有机相时峰形更为尖锐。进一步考察流动相中添加不同含量甲酸对化合物的影响。结果显示，未加甲酸时，曲托喹酚的响应值最高，但峰形展宽严重；加入0．1%甲酸后，峰形尖锐，但化合物的峰面积降低约20%；继续加大甲酸浓度，实验结果无变化。综合考虑，本实验选择0．1%甲酸水-乙腈作为流动相。由于定溶液对化合物在色谱柱上峰形存在影响，高比例有机相溶剂易导致色谱峰出现溶剂效应，通过实验比较，采用0．1%甲酸水-乙腈（9∶1）定容，可保证化合物峰形良好且保留时间稳定。图2为优化条件下0．5 ng/mL曲托喹酚标准溶液的定量离子色谱图。

图2 0．5 ng/mL曲托喹酚标准溶液的定量离子色谱图Fig．2 Chromatogram of quantitative daughter ion of 0．5 ng/mL tretoquinol standard solution

2.4 基质效应

采用5 ng/mL基质标准溶液与5 ng/mL溶剂标准溶液分别进样3针，将峰面积平均响应值进行比较，利用以下公式评价基质效应的影响［12］：基质效应（ME）=（B/A），其中：B为样品基质中添加相同含量曲托喹酚的响应值；A为相同含量标准溶液的响应值；ME>1，说明存在基质增强效应；ME<1，说明存在基质减弱效应。实验发现经MCX柱净化后基质效应的影响明显减弱，比如白胡椒净化前基质效应为0．08，净化后基质效应为0．86，相差近10倍。但经净化后各基质表现的基质效应不同（见图3）。为保证定量结果的准确性，实验采用空白基质溶液对定量结果进行校正。

图3 曲托喹酚的基质效应Fig．3 Matrix effect of tretoquinol

2.5 线性关系、检出限与定量下限

取标准溶液适量，用花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陈皮、栀子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香叶18种空白基质溶液分别配制成0．1、0．2、0．5、1、5、20、50 ng/mL标准工作液，在“1．4”条件下依次测定。以各组分的峰面积为纵坐标（y），对应的质量浓度为横坐标（x，ng/mL）进行线性分析。结果显示，各基质中的曲托喹酚均在0．1～50 ng/mL范围内呈良好线性关系，相关系数（r）为0．998 5～0．999 9。在空白样品中添加低浓度的标准溶液，按“1．3”步骤进行样品前处理后进样测定，以信噪比S/N≥3和S/N≥10确定各基质的检出限（LOD）均为0．2μg/kg，定量下限（LOQ）均为0．5μg/kg。方法适用于曲托喹酚的定量分析。

2.6 准确度与精密度

在优化条件下，用空白样品进行加标回收和精密度实验，在18种香辛调料中添加0．5、2、10、100μg/kg 4个不同质量浓度的标准溶液后，按本方法进行加标回收率实验，每个水平平行测定6次，测得曲托喹酚的回收率为74．5%～98．8%，相对标准偏差（RSD）为3．1%～9．1%（见表1）。方法具有较好的准确度和精密度。

表1 方法的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 1 Spiked recovery and RSD of the method（n=6）

2.7 实际样品的分析

采用本方法对随机在市场上购买的十三香、五香粉、烧烤粉、孜然粉、蒜香粉、麻辣粉共20份样品进行测定，均未发现阳性结果。

3 结 论

本研究采用酸性乙醇提取，MCX固相萃取柱净化，以超高效液相色谱－串联四极杆质谱法建立了香辛调料中曲托喹酚的检测方法。结果表明，方法的检出限（LOD）为0．2μg/kg，定量下限（LOQ）为0．5μg/kg，平均回收率为74．5%～98．8%，相对标准偏差（RSD）为3．1%～9．1%。此方法简单、快速，普适性强、灵敏度高。该方法的建立可为体育赛事香辛调料中曲托喹酚的分析提供技术参考。