UPLC-MS/MS法测定苦蘵宿萼中physalin H和physalin D的含量

王灵艳，戴亚平，薛 洁,2，俞春娜,2，王慧中,2，展晓日,2

(1. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州311121； 2. 浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室，浙江 杭州 311121)

苦蘵PhysalisangulataL.为茄科酸浆属植物，是一种民间常用药用植物，其根、茎、叶、带果实的宿萼等均可入药，主要用于疟疾、哮喘、咽炎、前列腺炎、慢性乙肝、消化和肠道疾病的治疗[1].现代研究表明苦蘵中主要化学成分为甾体类化合物，包括酸浆苦味素类(physalins)和睡茄内酯类(withanolides)等，该类化合物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、镇痛等药理作用[2-6]，是苦蘵的主要有效成分.目前苦蘵相关研究主要集中在化学成分分离及药理活性研究方面，质量控制研究相对较少，但通过前期研究我们发现不同来源苦蘵药材质量差异较大，为了保障苦蘵在临床上的用药安全、有效，进行苦蘵质量控制研究是十分必要的.本研究针对苦蘵中2个主要的酸浆苦味素类成分physalin H和physalin D，采用液质联用法对其进行定量研究，建立了苦蘵中physalin H和physalin D的质量控制方法，为进一步制定和完善苦蘵药材质量标准，有效控制苦蘵的质量提供了依据.

1 仪器与试药

美国Waters 公司ACQUITY UPLC液相色谱仪；美国AB/SCIEX 公司ABI 4000Qtrap质谱仪.

physalin D对照品(纯度>98%)由本实验室制备，physalin H对照品(纯度>98%)为浙江大学马忠俊教授课题组提供；甲酸(质谱级，德国 sigma 公司)，乙腈(色谱级，德国Merk公司)，水为超纯水(Millipore Milli-Q系统)，其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司).

14批苦蘵带宿萼果实采自不同地区，经本实验室冯尚国副教授鉴定为茄科Solanaceae酸浆属Physalis植物苦蘵的带宿萼果实，取其宿萼，低温干燥并粉碎，过40目筛，密封备用.

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A为水(含0.1%甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脱程序见表1；柱温35 ℃；流速0.3 mL·min-1，进样量1 μL.

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测方式：多反应检测(MRM)模式，采用正离子模式；源喷射电压：5 500 V；源温度(TEM)：100 ℃；帘气(CUR)：1.38×105Pa；雾化气(gas1)：3.45×105Pa；加热气(gas2)：3.79×105Pa，均为氮气.被测成分与内标的检测离子对，解簇电压(DP)和碰撞电压(CE)见表2，EP：10 V，CXP：10 V.

表2 质谱条件

在上述条件下检测得到内标溶液，physalin H、physalin D对照品溶液和样品溶液的MRM图，见图1.

A：内标溶液；B：physalin H对照品溶液；C：physalin D对照品溶液；D、E、F：样品溶液.

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备

取physalin H适量，精密称定，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得10 mg·mL-1的physalin H对照品储备溶液.

取physalin D适量，精密称定，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得10 mg·mL-1的physalin D对照品储备溶液.

2.3.2 内标溶液的制备

取异嗪皮啶适量，精密称定，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1 μg·mL-1的内标溶液.

2.3.3 样品溶液的制备

取苦蘵样品粉末(40目)0.025 g，精密称定，置于1.5 mL离心管中，分别精密加入800 μL甲醇、200 μL内标溶液，超声提取30 min，离心取上清液，0.22 μm滤膜过滤，即得.

2.4 定量限和检测限

定量限：信噪比S/N=10时样品的量作为定量限，该实验中定量限5 ng·mL-1.

检测限：信噪比S/N=3时样品的量作为检测限，该实验中检测限1 ng·mL-1.

2.5 线性关系考察

分别精密吸取“2.3.1”项下对照品储备液适量，分别制成含physalin H和physalin D 5、10、50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng·mL-1的溶液，按“2.1色谱条件”和“2.2质谱条件”进样测定.以峰面积(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到physalin H和physalin D的回归方程分别为

Y=146.48X+3 843.7，r=0.999 7；Y=57.839X+2 061.1，r=0.999 5.

说明physalin H和physalin D在浓度5～10 000 ng·mL-1范围内，线性关系良好.

2.6 精密度试验

分别精密吸取一定量的physalin H和physalin D的对照品溶液，将其配制成浓度为5 ng·mL-1混合对照品溶液，按“2.1色谱条件”和“2.2质谱条件”重复进样5次.physalin H和physalin D峰面积的RSD值分别为4.58%和2.16%，说明该仪器精密度良好.

2.7 稳定性试验

取某一产地的苦蘵样品，按“2.3.3”方法制备样品溶液，在4 ℃下放置0、2、4、6、8、24 h，按“2.1色谱条件”和“2.2质谱条件”进样.physalin H和physalin D峰面积的RSD值分别为3.94%和2.79%，说明苦蘵样品溶液4 ℃放置24 h稳定.

2.8 重复性试验

取同一产地苦蘵药材5份，按“2.3.3”方法制备样品溶液，按“2.1色谱条件”和“2.2质谱条件”进样.physalin H和physalin D含量的RSD值分别为2.63%和2.08%，说明该方法重复性良好.

2.9 加样回收试验

精密称取同一产地的苦蘵样品0.025 g，共9份，精密加入对照品适量，按“2.3.3”方法制备样品溶液，按“2.1色谱条件”和“2.2质谱条件”进样，测定，计算回收率.physalin H和physalin D的平均回收率分别为71.1%、71.0%，RSD值分别为1.36%、1.47%.说明加样回收率符合要求.

2.10 不同产地苦蘵中physalin H和physalin D的含量测定

取14个不同产地的苦蘵药材，按“2.3.3”方法制备样品溶液，按“2.1色谱条件”和“2.2质谱条件”进样，分别测定physalin H、physalin D的含量.结果见表3.

表3 不同产地苦蘵宿萼中physalin H和physalin D含量测定

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

分别比较了不同型号的色谱柱Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Thermo Hypersil BDS C18(150 mm×2.1 mm，1.9 μm)和 Agilent Zorbax SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，结果显示：Waters Acquity BEH C18色谱柱对于分析物的分离效果比较理想.

3.2 流动相的选择

以水-乙腈为流动相体系，由于physalin H和physalin D均含有羟基，pH值对其影响较大，通过调节pH值可获得较好的峰形，因此在流动相中加入适量甲酸可以提高响应、改善峰形.考察了流动相中甲酸体积分数分别为0、0.05%、0.1%对于化合物响应及峰形的影响，结果表明甲酸体积分数为0.1%时色谱峰的响应和峰形均较好，因此选择以水(0.1%甲酸)-乙腈(0.1%甲酸)为流动相.

3.3 结果分析

本研究建立的UPLC-MS/MS法，可同时准确地对苦蘵中physalin H和physalin D进行含量测定.但是不同来源苦蘵宿萼中physalin H和physalin D的含量差异较大，这种差异的存在可能是因为不同地域环境引起的化学成分的天然变异，它对苦蘵疗效的影响需要进一步研究，因此不能仅采用指标性成分含量测定作为评价药材质量好坏的标准，后续可以结合化学指纹图谱法，对其质量进行全面综合的评价，以保证苦蘵应用的安全、有效.