高通量反应纸喷雾质谱法批量测定蔬菜水果中微量甲醛残留

林秋雨，陈志伟，王园朝

(杭州师范大学材料与化学化工学院，浙江 杭州 311121)

甲醛是生物体正常代谢过程中自然产生的物质，空气、天然食品、加工食品特别是干制食品和冷冻食品中的防腐剂都含有甲醛[1-2].例如，香菇在正常发育过程中涉及将精氨酸转化为蛋氨酸[3]的反应，该反应过程中产生的甲醛高达40～380 mg/kg[4]．微量的甲醛不会危害到人类健康，但当人体摄入大量的甲醛时，可能会引起呕吐、昏迷，甚至死亡．因此，甲醛早已被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列为第一类“致癌物质”．由此说明食品中甲醛的控制与测定十分重要．

目前，食品中甲醛的检测方法主要采用分光光度法和液相色谱法[5]．分光光度法是通过将甲醛与某种显色试剂反应生成一种有色化合物产物，在特定波长测定该产物的吸光度从而获得甲醛的质量浓度，其中最常见的分光光度法有乙酰丙酮法[6]、AHMT法[7]、盐酸苯肼法[8]和间苯三酚法[9]．王燕[6]优化了水发食品中甲醛的检测条件，利用乙酰丙酮法对水发食品中的甲醛进行定量测定；陈永锋等[7]利用AHMT分光光度法测定生活饮用水的甲醛，水中甲醛的检出限为 0.05 mg/L；李敏等[8]探讨了不同实验条件对显色的影响，并采用盐酸苯肼分光光度法对腐竹中甲醛残留量进行定量分析，结果表明，其方法检出限为0.001 μg/mL；罗悦[9]研究了用间苯三酚定量测定甲醛的方法，该方法可应用于水发食品、环境空气等样品中甲醛的快速定量．液相色谱法需先将甲醛衍生化以便紫外检测，再经色谱分离后得到相应的色谱峰，通过峰面积进行定量分析[10]．如Netto等[11]利用甲醛与2,4-二硝基苯肼的衍生化反应，建立了一种测定牛奶中甲醛的高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)，检出限为20.0 μg/L．以上两种常见的甲醛分析方法均存在分析速度慢、灵敏度低等问题．

近十几年来，常压电离质谱技术得到了迅速发展，是一种开放环境中对样品直接进行电离分析的质谱新技术，具备高灵敏度、高效率和高选择性等优点[12]．其中，纸喷雾质谱法[13-14]不但具有常压电离质谱技术的普遍优点，而且简化了操作步骤，降低了分析成本，扩大了质谱分析的应用范围．因此，纸喷雾质谱法被广泛地应用于生物[15-16]、药物[17]和环境分析[18]等方面．由于其独特的技术特点，纸喷雾质谱法也被认为是高通量质谱分析[19]的理想选择，它可以通过对喷雾进样装置进行简单的改造，进一步提高仪器对样品的分析能力，使其适用于批量分析．如Shen等[20]设计了一种新的高通量装置，利用纸喷雾质谱法应用于牛血液样本中苏尼替尼和尼古丁这两个组分的检测，方法的检测速度达到了7 s/样品，大大提高了分析效率．

质谱法中食品的前处理方法主要有超声法[5]、蒸馏法、浸泡法和蛋白沉淀法．其中超声法是一种提取效率较高，操作较简单的前处理方法．以超声法作为样品的前处理方法，选择丹磺酰肼为衍生化试剂，标准丹酰胺溶液为内标物质，设计并应用了一套简便的多样品喷雾进样装置，建立了一种批量测定食品中微量甲醛残留的高通量反应纸喷雾质谱法，对10种常见蔬菜水果食品中的甲醛进行了快速检测．该方法具有高效率、高灵敏度和高选择性的检测特点，为食品中甲醛的批量检测提供了一种新的途径．

1 材料和方法

1.1 主要仪器与材料

轨道离子阱质谱仪(LTQ-Orbitrap XL ETD型，美国Thermo公司)；电子天平(BS124S型，德国赛多利斯公司)；超纯水仪(Milli-Q型，美国Millipore公司)；搅拌机(BL25B31型，中国佛山市美的集团有限公司)；超声波清洗器(Q-250型，中国昆山超声波仪器有限公司)；高速离心机(TGL-16型，中国金坛荣华仪器制造有限公司)．

丹磺酰肼、2,4 -二硝基苯肼、苯肼、2,4,6-三氯苯肼、吉拉德T试剂、丹酰胺均购自上海百灵威化学；甲醛(9.6 mg/mL)购自阿拉丁，用超纯水配成标准溶液(1.0 mg/mL)；冰醋酸购自国药化学试剂有限公司；定性快速滤纸由杭州双圈滤纸有限公司提供；所有蔬菜水果样品均从当地市场随机采购．

1.2 仪器工作条件

轨道离子阱质谱仪的工作条件会影响最终检测结果的准确度与精密度．优化后的仪器工作条件如表1所示．该仪器控制均通过Xcalibur软件执行．

表1 轨道离子阱质谱仪的工作条件

1.3 样品前处理

食品样品经打碎研磨后，准确称取10.000 0 g倒入100 mL烧杯中，再加入50 mL超纯水．用超声波清洗器超声处理30 min后，将烧杯中的溶液转入离心试管中，于高速离心机上以12 000 r/min离心15 min，收集上层清液于50 mL离心管中，备用．

1.4 实验方法

滤纸被切割成11个等腰三角形组成的阵列，其尖端角度均为30°，底边长度均为10 mm，附在一块长为15 cm的玻璃板上．用刀切割底部的矩形部分，使每个三角形滤纸均不相连．玻璃板被安放于升降台上，根据图1所示，通过升降台的高度调整，控制玻璃板上的第一个三角形滤纸尖端和质谱仪入口之间的距离为5 mm．使用一台铁架台固定用于通电的铜条，调整铁架台的高度，使铜条紧贴在三角形滤纸的后端．用移液枪将10 μL含质量浓度为500 μg/L的丹酰胺(内标)的样品溶液滴加在滤纸上．干燥1 min后，滴加20 μL喷雾溶剂(由质量浓度为20 mg/L的丹磺酰肼和体积分数为1%的乙酸组成的乙腈溶液)进行在线衍生化反应．接着，在铜条末端施加+4.0 kV的电压，产生喷雾进样，质谱仪在正离子模式下检测并记录相应的质谱数据．完成第一次样品溶液的测定后，平移玻璃板，使下一个三角滤纸尖端距质谱仪入口5 mm处，进行第二次样品溶液的检测(与第一个样品步骤相同)，其他系列样品依次检测．

2 结果与分析

2.1 衍生剂种类的选择

衍生剂种类是影响衍生产物信号强度的重要因素之一．因此，选择了丹磺酰肼、2,4-二硝基苯肼、苯肼、2,4,6-三氯苯肼、吉拉德T等作为衍生化试剂，分别研究了5种衍生化试剂与甲醛溶液的衍生化反应，对产生的衍生产物信号强度进行比较，结果如图2所示．发现丹磺酰肼作为衍生剂时，衍生产物——腙的信号强度远远高于其他衍生产物．

丹磺酰肼与甲醛的衍生化反应如图3所示．在正离子模式下以丹磺酰肼为衍生剂进行反应纸喷雾质谱分析得到的质谱图(图4)和采用碰撞诱导解离(CID)得到的甲醛与丹磺酰肼的衍生产物——腙的MS/MS谱图(图5)，均验证了这个反应在纸喷雾质谱实验过程中能够正常进行．

图3 丹磺酰肼与甲醛的反应式

图4 在全扫描模式下以丹磺酰肼为衍生剂进行纸喷雾质谱分析得到的质谱图

2.2 实验条件的优化

为了检测出有适当强度和稳定性的衍生产物腙(m/z278.095 8)的质谱信号，研究利用单变量法优化了纸喷雾质谱法在正离子模式下的工作条件．实验在0.1～3.0 mg/L范围内对丹酰胺(内标)的质量浓度进行了优化．当丹酰胺的质量浓度为0.5 mg/L时，质子化的腙与质子化的丹酰胺的峰面积比相对适中(图6)，有利于定量分析．喷雾电压的高低影响着滤纸的毛细作用．喷雾电压越高，毛细作用越强，提高了目标分析物的离子化效率．但过高的喷雾电压会造成较强的电晕放电，从而影响了目标分析物的信号检测[21]．结果表明，+4.0 kV的喷雾电压能产生最大的质谱信号(图7)．喷雾溶剂的酸度在衍生化反应中起着重要的作用，适当的酸度环境促进了质子化过程，使羰基更亲电，有利于丹磺酰肼中-NH2的进攻，从而加速了衍生化反应的进行[22]．由图8可知，当乙酸的体积分数为1.0%时，质子化的腙与质子化的丹酰胺的峰面积比最高，质谱数据最佳．

图7 喷雾电压对峰面积比的影响

图8 乙酸在喷雾溶剂中的体积分数对峰面积比的影响

2.3 标准曲线与线性范围

将10 μL含质量浓度为500 μg/L的丹酰胺(内标)的不同质量浓度甲醛标准溶液(3、5、10、50、100、150、200、250、300 μg/L)分别加载到三角形滤纸上，干燥后分别滴加20 μL喷雾溶剂(由质量浓度为20 mg/L的丹磺酰肼和体积分数为1%的乙酸组成的乙腈溶液)，然后向铜条施加+4.0 kV的喷雾电压，每1 min检测1种质量浓度的甲醛标准溶液，在正离子模式下记录质谱数据．以甲醛的浓度为横坐标，质子化的腙与质子化的丹酰胺的峰面积比为纵坐标，作图得到标准曲线(图9).由图9可知，甲醛的质量浓度在3～300 μg/L 范围内呈现出良好的线性关系(R2=0.999 3)，方法检出限(LOD)为1.0 μg/L．

图9 高通量反应纸喷雾质谱法测定甲醛的标准曲线

2.4 样品的定量分析及加标实验

该高通量反应纸喷雾质谱法已成功应用于10种蔬菜水果样品中甲醛的定量分析．每种样品提取液各取10 μL，用超纯水稀释20倍，再分别加入相同体积(200 μL)的质量浓度为1 mg/L的丹酰胺作为内标物质．在上述优化仪器参数和实验条件下分别测定，并按标准曲线线性方程计算样品中的甲醛．为验证方法的准确度，在每种样品中分别按大、中、小3个级别量加入甲醛标准溶液，进行加标回收实验．结果计算出的所有样品加标回收率在93.5%～117.9%范围，测定结果的相对标准偏差小于10.5%(表2)．通过方法检出限换算出样品的检出限为0.2 mg/kg．

表2 高通量反应喷雾质谱法测定食品中甲醛的质量分数、回收率及精密度(n=3)

3 结论

以丹磺酰肼为衍生剂、丹酰胺为内标物、超声法为样品前处理方法，建立了一种新型的高通量反应纸喷雾质谱法，可快速批量检测食品中微量甲醛．该方法已应用于10种不同蔬菜水果中甲醛的检测．与传统的分光光度法和HPLC-UV法相比，该方法不涉及复杂的分离过程，大大节省了分析所需的时间，检测灵敏度高、选择性好、操作简便，为快速大批量测定食品中甲醛提供了一种新的可选择的方法．