不同剂量双表达蛋白VP2-IL-18免疫原性的比较

2021-08-05王新华孔胶胶付嘉宁

西南农业学报 2021年5期

孔娜,王新华,孔胶胶,付嘉宁

(1.菏泽学院药学院，山东菏泽 274015;2.菏泽医学专科学校，山东菏泽 274000)

【研究意义】传染性法氏囊病(IBD)传统疫苗存在免疫失败等多种问题，VP2是传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白和保护性抗原[1]，可采用多种表达系统表达出具有一定免疫原性的VP2蛋白[1-2]，但需要通过合适的佐剂提高免疫效果。【前人研究进展】mIL-18是一种新发现的细胞免疫调节因子[3]，能诱导生成IFN-γ，还可以激活能清理病毒的CD8+T细胞[4]和发挥协调机体体液免疫和细胞免疫功能的CD4+T细胞[5-6]。孔娜[7]将双表达蛋白VP2-IL-18免疫雏鸡，能促进CD4+T、CD8+T细胞的增殖和抗体水平的增加，还可以产生90 %保护率。研究表明IL-18对机体的免疫反应除了有增强作用，还有减弱作用，这主要取决于其剂量[8-9]。【本研究切入点】因此本试验采用不同剂量双表达蛋白VP2-IL-18免疫鸡，并对他们的免疫原性进行了比较。【拟解决的关键问题】摸索VP2-IL-18的最佳免疫增强剂量，为研制新型高效的IBD基因工程疫苗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1日龄SPF鸡购自山东济南赛斯有限公司；FITC标记的鼠抗鸡CD4单抗和R-PE标记的鼠抗鸡CD8а单抗购自北京博蕾德生物科技有限公司；IBDV ELISA抗体检测试剂盒购自IDEX公司；vvIBDV-GX8/99株为山东农业大学朱瑞良教授从广西收集的IBDV强毒株，毒价为105.5LD50/0.2 mL。

1.2 双表达蛋白VP2-IL-18的制备

将鸡IL-18成熟蛋白基因(mChIL-18) 先插入进双表达载体pFastBacTMdual的PPH下游，构建重组质粒pFastBacTMdual-IL-18，再将IBDV VP2基因插入pFastBacTMdual-IL-18的 PP10下游，构建重组质粒pFastBacTMdual-VP2-IL-18。然后利用Bac-to-Bac系统表达双表达蛋白VP2-IL-18[6]，并制备成油乳制剂。

1.3 动物分组免疫

120只14日龄SPF鸡随机分成6组，每组20只，选用颈部皮下多点注射。Ⅰ组注射含100 μg VP2-IL-18的油乳制剂；Ⅱ组注射含150 μg VP2-IL-18的油乳制剂；Ⅲ组注射含200 μg VP2-IL-18的油乳制剂；Ⅳ组注射含250 μg VP2-IL-18的油乳制剂；Ⅴ组注射含300 μg VP2-IL-18的油乳制剂；Ⅵ组为阴性对照组。所有鸡均14日龄一免，28日龄二免。

1.4 ELISA抗体检测

分别于一免后第0、7、14、21、28和35天每组随机抽取8只，采集翅静脉非抗凝血分离血清，利用IBDV ELISA抗体检测试剂盒检测ELISA抗体滴度。

1.5 CD4+T、CD8+T细胞增殖反应

分别于一免后第0、7、14、21、28和35天每组随机抽取8只，采集翅静脉抗凝血分离外周血淋巴细胞。利用FITC标记的鼠抗鸡CD4单抗和R-PE标记的鼠抗鸡CD8а单抗，通过流氏细胞仪检测CD4+T和CD8+T淋巴细胞的增殖情况。

1.6 攻毒试验

一免后第35天经点眼滴鼻等途径使用vvIBDV-Gx8/99毒株攻击，攻毒剂量为每只100 LD50/0.2 mL，攻毒后第6天记录各组死亡数，然后全部扑杀剖检观察病理变化。

1.7 数据分析

所得数据用EXCEL和SPSS进行统计学处理。

2 结果与分析

2.1 ELISA抗体检测

各试验组虽能提高抗体水平(图1)，但需要二免才能产生更高水平抗体。Ⅲ组在一免后第7天与Ⅳ组和Ⅴ组差异不显著(P>0.05)，但从一免后第14天开始差异显著(P<0.05)，且Ⅳ组和Ⅴ组比Ⅰ组和Ⅱ组抗体滴度小。

2.2 CD4+T细胞增殖反应结果

各试验组虽都能促进CD4+T细胞增殖(图2)，但只有Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组在加强免疫后才能保持持续性上升趋势；Ⅳ组和Ⅴ组二免后仍呈下降趋势。Ⅲ组增殖水平最高，在一免后7 d起均与其他试验组和对照组差异显著 (P<0.05)。

2.3 CD8+T细胞增殖反应结果

各试验组虽都能促进CD8+T细胞增殖(图3)，但一免后7 d又呈下降趋势；只有Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组在加强免疫后才能保持缓慢上升趋势；Ⅳ组和Ⅴ组二免后仍呈下降趋势。Ⅲ组增殖水平最高，在一免后7 d起与其他组差异越来越显著 (P<0.05)。

2.4 攻毒保护率

Ⅲ组保护率最高为90 %(表1)，且无1只死亡；Ⅰ组和Ⅳ组保护率均为70 %，但Ⅰ组死亡率比Ⅳ组高；Ⅱ组和Ⅴ组死亡率相同，但Ⅱ组保护率比Ⅴ组高；Ⅶ组全部感染。

表1 vvIBDV-Gx8/99毒株攻击后各组的死亡数、感染数和保护率

3 讨论

IL-18对机体的免疫调节具有双向作用[10]，即增强和减弱两方面[11]。所谓免疫增强是指用人为措施，全面或选择性提高机体的免疫功能，以达到治疗疾病的目的，是一种主动免疫过程[12]。关于免疫减弱前人研究很少。IL-18可促进已被刺激的T细胞的增殖及增加培养的T细胞的IL-2的产生[13]，但IL-2对免疫应答具有增强和抑制的双向作用, 因此对维持机体免疫平衡具有非常重要的作用,在临床上用于病毒感染、免疫缺陷病及自身免疫病的治疗[14-15]。还有报道显示IL-18长期而过量的使用可使动物产生严重的副作用[16],如消瘦和消化道出血。

本试验结果显示Ⅲ组ELISA抗体水平最高，从一免后与Ⅳ组和Ⅴ组第14天开始差异显著(P<0.05)，且Ⅳ组和Ⅴ组比Ⅰ组和Ⅱ组抗体滴度小。各免疫组都能促进CD4+T增殖，且Ⅲ组增殖水平最高，在一免后7 d起与其他组差异越来越显著 (P<0.05)，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组在加强免疫后能保持持续性上升趋势，Ⅳ组和Ⅴ组却呈下降趋势。各免疫组虽均能促进CD8+T增殖，但Ⅲ组增殖水平最高，在一免后7 d起与其他组差异越来越显著 (P<0.05)，且Ⅳ组和Ⅴ组比Ⅰ组和Ⅱ组增殖幅度小。攻毒试验结果显示，Ⅲ组保护率最高为90 %，Ⅱ组为75 %，Ⅰ组和Ⅳ组保护率均为70 %，Ⅴ组为60 %。以上结果表明VP2-IL-18具有良好的免疫原性，且200 μg为最佳免疫剂量，高剂量效果反而不如低剂量，即不呈现高剂量依赖。