峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用

周罗琴，田宏现

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)



峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用

周罗琴，田宏现

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

摘要：研究峨嵋双蝴蝶植物水提物的抗五步蛇毒作用.建立小鼠五步蛇毒中毒模型，观察小鼠的中毒表现，并统计小鼠的死亡率，比较小鼠组织出血、组织坏死及组织溃疡状况.结果发现，峨嵋双蝴蝶植物水提物给药组动物的死亡率较模型组的明显下降，局部和全身症状较轻，而且随着剂量的增加症状显著减轻，尤其是对于组织的保护作用比较明显.峨嵋双蝴蝶植物水提物具有抗五步蛇毒作用，能降低蛇毒毒性.

关键词：双蝴蝶提取液；五步蛇；抗毒性；保护率

五步蛇又称尖吻蝮、蕲蛇等，是中国重要10大毒蛇之一.五步蛇个体大，毒液多，其蛇毒中含有纤溶酶、凝血酶样酶、蛋白水解酶、出血因子等20余种蛋白质，会导致伤后发病急剧，变化迅速，对血液及循环系统破坏尤为明显，属于循环毒，易造成广泛出血、溶血和组织坏死，如不及时救治，容易造成伤肢致残，甚至危及生命[1-4].现在治疗五步蛇毒的药相继问世，除常规抗五步蛇毒血清和季德胜蛇药外，还有蛇伤1号合剂[5]、青龙蛇药[6]、A草蛇药片[7]等以中草药为主的单方及验方.传统中药治疗蛇伤历史悠久，积累了丰富的经验，对提高人体的抗蛇毒能力、泄毒排毒、消除中毒症状、减少组织损伤具有独到的功效.常用治疗蛇毒的中草药通常有清热解毒、通腑泄火、凉血止血等功能，具抗菌消炎、改善微循环等作用，如黄莲、半支莲、丹皮、丹参、三七粉、地耳草、地胆头、岗梅根、半夏、天南星等[8-10].

笔者对峨嵋双蝴蝶(Tripterospemumcordatum)植物提取液对抗五步蛇毒的作用进行了研究.峨嵋双蝴蝶，双蝴蝶属，别名肺形草、黄金钱，属于龙胆科多年生常绿缠绕草本.全球大约17种，中国有15种，其中中国台湾分布2种，它们都具有相似的形态和利用价值，主要分布于湖南省、湖北省、重庆市、四川省、贵州省、云南省等地区.中医书记载，峨嵋双蝴蝶性寒、味甘辛，具有润肺止血、清热利尿、解毒、消肿等功能[11].有相关实验研究[12]表明，从Tripterospemum中提取的Terahydoxy xanthone(THXS)对鼠科动物的白血病毒的反转录具有强烈的抑制作用；也有台湾学者[13]实验证明，TripterospemumLanceolatum中的Norathyrial对循环系统和神经系统的炎症有明显的抑制功能；体外实验[14]也证明它有较好的抑菌活性；还有文献[15]记载它作为治疗蛇伤的中草药.

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器KQ-500DB型数控超声波清洗器，购于昆山市超声仪器有限公司；RE52-99蒸发器，购于上海市亚荣生化仪器厂；SHB-III循环水式多用真空泵，购于郑州市长城科工贸有限公司；MDF-V2086S低温冷冻干燥机，由军事医学科学院实验仪器厂研制，由北京市四环科学仪器厂提供.

1.1.2 实验动物清洁级BACB/C小白鼠数只，雌雄兼用，体重18~23 g，由广州市中山大学实验室动物中心提供；KM种小鼠，体重18~22 g，购于中南大学湘雅医院实验动物中心.

1.1.3 实验植物及药物峨嵋双蝴蝶采集于湖南省怀化市中方县.取全草洗净，自然阴干；称干重536 g浸泡于6 500 mL水中24 h，通过低温(60 ℃)超声波抽提2 h，过滤.滤渣加入1 250 mL水第2次抽提，过滤后再收集滤渣加入1 000 mL水和800 mL水重复抽提第3、第4次，第2到第4次抽提时间分别为1 h.最后共收集滤液6 500 mL，合并滤液通过蒸发器浓缩至600 mL.将得到的浓缩液用低温冷冻干燥机干燥，得浸膏粉末113 g,放置冰箱中保存备用(临用前加蒸馏水稀释至所需实验质量分数).

1.1.4 蛇毒纯化干粉，购于广州市养蛇场.

1.2 实验方法

1.2.1 峨嵋双蝴蝶水提物动物急性毒性实验因预实验发现该药物毒性过低，LD50无法测出，故进行最大耐受量实验.小鼠口服灌胃最大耐受量实验：选用18~22 g健康KM种小鼠40只，雌雄各半，随机抽取，均匀分组，给药组与对照组各20只，分笼饲养2 d，实验前16 h禁食.给药组按一次性灌胃给药，所配制的药液每毫升含峨嵋双蝴蝶水提物0.55 g(最大溶解度)，小鼠灌胃容积为0.04 mL/g(最大容积)，小鼠给药量为峨嵋双蝴蝶水提物22.0 mg/g，合生药为79.3 mg/g.对照组给等量的生理盐水0.04 mL/g，观察7 d.结果给药组与对照组均未见异常，12 h内健在，72 h后处死解剖尸体验心、肺、肝、脾、肾等脏器，肉眼未见异常.结论：小鼠灌胃给药峨嵋双蝴蝶水提浸膏粉的最大耐受量(MTD)为22.0 mg/g，合生药为79.3 mg/g，相当于人临床用量的165倍.

1.2.2 五步蛇毒致死剂量和时间的确定为了节省实验动物，用序贯法(上下法)计算LD50，缺点是动物必须逐个进行实验，下一只动物用药剂量又决定于上一只动物的反应情况，实验时间较长，而它适合急性致死药物的动物实验.选用10只18~22 g健康小白鼠，雌雄各半，随机抽取.分别配制好4种不同质量分数的五步蛇毒生理盐水注射液，通过预试验确定剂量分组，在本实验中即为2.5，2，1.5，1 μg/g这4种.实验先从较大剂量开始，第1只动物用五步蛇毒生理盐水注射后，如果发生死亡，在表中以“+”记录，下一只动物就降低一级剂量注射；相反，如果动物存活，在表中以“-”记录，下一只动物就用高一级的剂量；依此类推.最后1只动物虽未进行实验，但在表格内仍占位置，以“×”符号表示.本方法所用动物总数∑n也应事先定好，一般∑n=10即可获得满意的结果.实验结果如表1所示，其中：D为蛇毒致死剂量实验组；S(safe)为存活数；F(fatal)为死亡数;n(number)为剂量组的动物数；X=logD，即剂量的对数.

表1　五步蛇毒半数致死剂量(LD50)的实验

根据致死剂量实验结果，选择健康的BACB/C小白鼠数只，体重为18~22 g,雌雄各半，随机抽取分组.按1.6 μg/g蛇毒质量分数加3 mL的生理盐水(0.32 g/L)配成注射液注射小鼠(0.1 mL/只).实验结果表明，注射蛇毒后能使动物致死时间控制在6 h左右，符合本实验时间规定要求(3~8 h)，因此确定为本实验的注射质量分数.

1.2.3 小白鼠中毒模型建立将BACB/C小白鼠随机分配为峨嵋双蝴蝶植物水提物低、中、高剂量组及空白组、模型组(五步蛇毒中毒损伤组)，各组小白鼠15只.峨嵋双蝴蝶植物水提物低、中、高剂量组给予峨眉双蝴蝶植物水提浸膏(分别为成人用量的1.5，3，5倍)，空白组和模型组给予相同剂量的生理盐水.以上各组动物均在实验前禁水16 h，各实验组按每只0.5 mL的剂量灌胃，连续7 d给药，每日给药1次.除空白组外，各组小鼠均于末次给药后1 h，于每只腹腔注射五步蛇毒100 μg，建立小鼠五步蛇毒中毒模型.

1.2.4 小白鼠中毒表现观察注射蛇毒后由实验人员轮流24 h观察，记录各组动物各个时间段内的局部症状以及呼吸、食欲、活动等全身状况，以动物的死亡数累计各组的实验结果.计算各组动物死亡率和保护率(模型组死亡率-给药组死亡率=保护率).按死亡率的百分率显著性检测进行统计分析[16].24 h后解剖各实验组小鼠，观察其组织出血量，组织坏死面积以及溃疡发生面积，各指标程度的轻重用“+”的个数表示，越多表示程度越重.

2结果与讨论

2.1 中毒表现

除空白组外，各组小鼠从注射五步蛇毒数分钟后，注射部位充血开始，表现为呼吸急促，眼睛瞳孔缩小，全身缩成一团，行动缓慢，并均有不同程度的嗜睡、懒动等症状.这些症状模型组动物表现得更为明显，该组死亡10只，死亡动物都有肛门出血等现象.各剂量组注毒后也出现一些死亡，但并发症状比模型组所表现的程度轻.3h后可以看到注射部位充血严重，局部皮肤均出现紫绀、溃烂如烫伤样.

2.2 死亡率和保护率

由表2可以看出，各剂量组都表现了不同程度的保护情况，尤其是高剂量组的峨嵋双蝴蝶浸膏溶液对五步蛇毒抗性明显，保护率高达60%，死亡率明显降低.这说明高剂量的峨嵋双蝴蝶浸膏溶液具有较强的抗五步蛇毒性的作用.

表2　不同剂量药物对中毒小鼠的保护情况

2.3 组织坏死对比

动物中毒死亡后，将各剂量组和模型组动物取样解剖，与正常健康小鼠(空白组)解剖做对比实验.健康小鼠血液鲜红、血流正常，肝、肾、脾等内脏无充血等异常现象.而中毒小鼠局部注射部位溃烂，出现结痂

表3　局部注射蛇毒后各组织中毒程度对比

注以上表现程度轻重由“+”多少来表示.并形成血肿块，解剖脏器均有不同程度的充血，血液呈黯红，血流缓慢，严重的情况肉眼可见肝脏坏死.解剖前后还对各剂量组和模型组的中毒状况作了对比，观察各组小鼠的中毒情况，并做详细记录.表3示出以各组注毒后所出现的局部肌肉组织的出血、坏死和溃疡情况为例，不同质量分数的峨眉双蝴蝶植物水提浸膏对抗五步蛇毒的结果.

由表3可知，模型组中毒动物出血很少，原因是组织充血开始，局部皮肤有瘀斑，出现不同程度的坏死、溃烂，血液流动缓慢；而各剂量组随着药物质量分数的提高，中毒程度呈减轻趋势.特别是高剂量组受药物保护后，对中毒小鼠的组织坏死与溃疡情况保护明显，血液外流速度与健康小鼠无异常.这说明峨嵋双蝴蝶浸膏溶液具有抗五步蛇毒之功效，并对组织坏死有明显保护作用.

3结语

在中国，用中草药治疗蛇伤的历史悠久.例如民间收集了一些具有抗蛇毒作用明显的中草药单方、验方，如广东蛇药、广西蛇药、群生蛇药、熊山蛇药、毛萝藦注射液、A草蛇药片等[17]，这些药方材料易得，疗效显著.本实验提取天然植物峨眉双蝴蝶其有效成分制成浸膏，配成不同质量分数的药剂溶液进行对抗五步蛇毒实验.结果表明，峨眉双蝴蝶浸膏溶液能明显改善蛇毒中毒症状，并随着浸膏溶液质量分数的增加，中毒组织症状呈减轻趋势，尤其是以成人剂量的5倍给药，可降低五步蛇毒中毒小白鼠的死亡率，说明峨眉双蝴蝶浸膏溶液对中五步蛇毒的动物具有明显的保护作用.

从本实验来看，峨眉双蝴蝶植物水提物具有缓解蛇毒扩散、控制病情发展、提高疗效的作用，但是它对抗蛇毒的具体化学成分还不清楚，有待进一步研究.双蝴蝶属植物中除齐墩果酸和芒果甙外，有资料表明还有2种酸类物质(oleanolicacid和norathyriol).对峨嵋双蝴蝶的分析表明，其齐墩果酸的质量分数达1.51 mg/g[18].然而，近几年来，对民间具有抗蛇毒作用的中草药进行研究的结果表明：抗蛇毒有效成分为有机酸，并且药理实验证明有机酸钾钠盐的保护作用要比游离的有机酸强.因此，可以认为此类植物与其他中草蛇药一样富含多种有机酸，当然也并不是所有的功能都由有机酸来体现，其他成分如糖、黄酮甙等同样能增强有机酸的保护作用.另外，除了有机酸，药物中的无机成分也起到协同作用，因为单一组分的抗蛇毒效果远不如与其他成分协同之下所起作用显著[19]，因此峨眉双蝴蝶抗蛇毒的有效成分量效关系及与其他成分协同作用的解毒机理有待进一步研究.

参考文献：

[1] 李清平,周文忠,刘治昆.五步蛇咬伤临床研究进展[J].蛇志,2012,24(1):58-60.

[2] 苏煌财,许云禄,林玉仙.液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶[J].药品评价,2014,11(24):29-31.

[3] WANG Shasha,XU Xiaolong,GAO Shang,et al.Purification and Partial Characterization of a Novel Fibrinogenase from the Venom ofDeinagkistrodonAcutus:Inhibition of Platelet Aggregation[J].Protein Expression and Purification,2014,99:99-105.

[4] TANG Songshan,WANG Xiaohua,ZHANG Juanhui,et al.Biochemical Properties and Comparative Pharmacology of a Coagulant fromDeinagkistrodonAcutusSnake Venom[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,49(1):90-98.

[5] 熊广,曾仲意,陈彩凤,等.蛇伤一号合剂治疗五步蛇咬伤临床观察[J].蛇志,2004,16(1):21-22.

[6] 邱光泽,黄道斋,丁惠堂,等.青龙蛇药对眼镜蛇毒中毒动物的保护实验及临床药理[J].蛇志,1989,1(4):27-28.

[7] 吕宗友,李州朝.A草蛇药抗蛇毒动物实验[J].医学临床研究,1986,27(6):16-17.

[8] 周建平,周小苹,邹荣生.196例五步蛇咬伤中毒的观察与护理[J].安徽中医临床杂志,2003,15(2):149-150.

[9] 蒋三元,唐荣德,张健民,等.10种广东本地清热解毒中草药体外抗蛇毒作用的实验研究[J].蛇志,2011,23(1):1-3.

[10] 田莎莎,李伟平,沈嫣婧,等.半夏、天南星和滴水珠抗五步蛇毒中毒作用的研究[J].中药药理与临床,2013,29(3):136-138.

[11] 舒普荣.中草药彩色图谱与验方[M].南昌：江西科学技术出版社，2000：392.

[12] CHANG CHUANG￣CHANG,LIN CHUN￣NAN,LIN JUNG￣YAW.Inhibition of Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity by Tetrahydoxy Xanthones Isolated from the Chinese Herb,TripterospemumLanceolatum[J].Antiviral Res.,1992(2):119-127.

[13] WANG JIH￣PYANG,LIN CHUN￣NAN,TENG CHE￣MING.Effect of Norathyriol,Isolated fromTripterospermumLanceolatum,on A23187￣Induced Pleurisy and Analgesia in Mice[J].Archives of Pharmacology,1994,350(1):90-95.

[14] 周罗琴,田宏现.峨嵋双蝴蝶提取物抑菌作用研究[J].中国农学通报,2015,31(7):154-158.

[15] 肖贵苹.毒蛇咬伤后的疗法[J].农村百事通,1999(8):45.

[16] 杜方麓,田文艺,田育望,等.毛萝藦中各部位对眼镜蛇毒中毒小鼠的保护作用研究[J].湖南中医学报,1994,14(3):51-52.

[17] 刘法锦,金幼兰,黄元萍.近年来具有抗蛇毒作用的中草药研究概况[J].中草药,1989,20(5):44-46.

[18] 敖琼,田宏现,杨宏健,等.RP-HPLC法测定峨嵋双蝴蝶中齐墩果酸的含量[J].中国医药导刊,2012,14(1):165-166.

[19] 梁彬.广东蛇药水溶性有效成分的组合与其协同作用的研究[J].中药通报,1985(8):42-44.

(责任编辑向阳洁)

Antitoxic Effect of Extracts of Tripterospemum Cordatum Against

DeinagkistrodonAcutusSnake Venom

ZHOU Luoqin,TIAN Hongxian

(College of Biology & Environmental Science,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

Abstract:The antitoxic effect of Tripterospemum cordatum aqueous extracts against Deinagkistrodon acutus snake venom is researched.The BACA/C mice were divided into five group according to the dosage of Tripterospemum cordatum aqueous extracts applied:low dosage,middle dosage,high dosage,blank group and model group,each group of health conditions being observed after 7￣days intra￣gastric administration.For the last time of administration,each group was intraperitoneally injected with Agkistrodon acutus snake venom after one hour later,then the mice’s poisoning performance was observed and the death rate was calculated,and each group of mice’s tissue bleeding,death and ulceration compared.The results showed that the aqueous extract of Tripterospemum cordatum at the low dosage,middle dosage and high dosage all reduced the mortality caused by Agkistrodon acutus snake venom poisoning and relieved some symptoms;with the increase of the dosage the symptoms decreased significantly,and the protection effect on the tissue was especially apparent.It can be concluded that the aqueous extract of Tripterospemum cordatum has antitoxic effect against Agkistrodon acutus snake venom and decrease the toxicity.

Key words:extracts of Tripterospemum;Deinagkistrodon acutus;antitoxic;protective rate

通信作者：田宏现(1953—),男,湖南保靖人,吉首大学生物资源与环境科学学院教授,博士,主要从事微生物学和林业生物技术研究.

作者简介：周罗琴(1987—),女,湖南邵阳人,吉首大学生物资源与环境科学学院硕士研究生,主要从事植物学研究

收稿日期：2015-01-17

中图分类号：R996.3

文献标志码：B

DOI:10.3969/j.cnki.jdxb.2015.03.019

文章编号：1007-2985(2015)03-0090-04