罗红霉素对中性粒细胞哮喘大鼠气道炎症、气道重塑和钙结合蛋白S100A9表达的影响

陈慧君，顾晓菲，田江华，戴元荣，涂军伟

中性粒细胞在哮喘的发生和发展中起到重要作用，中性粒细胞性哮喘患者具有痰液中性粒细胞数目增多、易感染病毒、有较长的吸烟史和对糖皮质激素抵抗等特点[1-2]。S100A9是钙结合蛋白S100家族中重要的一个成员，具备细胞调节活性，参与花生四烯酸、骨髓细胞成熟及细胞迁移等病理过程，在免疫炎症性疾病、肿瘤和疼痛等疾病的发生和发展中起到重要作用[3]。S100A9在中性粒细胞哮喘中的作用尚不清楚，哮喘患者痰液的蛋白质组学分析显示S100A9蛋白表达水平明显升高[4-5]。罗红霉素属于新一代大环内酯类抗生素，对哮喘的治疗有一定价值，但是其作用机制目前尚未完全明确[6]。本研究旨在探讨S100A9在中性粒细胞哮喘中的作用及罗红霉素可能的干预机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 18只6～8周健康雄性SPF级Brown Norway（BN）大鼠，体质量150～180 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2017-0022，饲养于温州医科大学实验动物中心。所有大鼠均自由进食和进水，12 h/12 h昼夜明暗交替照明。适应性喂养1周后，将大鼠分为对照组、模型组和罗红霉素组，每组6只。动物操作严格遵循美国国立卫生院颁发的《医学实验动物使用及关爱指南》。试剂和仪器：卵清白蛋白（OVA）和弗式完全佐剂（FCA）购于美国Sigma公司，罗红霉素购自美国MCE公司，苯巴比妥购于天津阿尔塔科技有限公司，瑞氏-吉姆萨染色试剂盒购于上海歌凡生物科技有限公司，多聚甲醛购于浙江联硕生物科技有限公司，S100A9、IL-17和IL-25酶联免疫吸附试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司。BLD-200Z摄像型三目倒置生物显微镜购于北京世纪科信科学仪器有限公司，HBS-1096C型酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和药物干预 参考Dejager等[7]研究建立中性粒细胞哮喘模型。模型组和罗红霉素组大鼠造模第1天、第8天时腹腔注射乳化（抗原乳化方法）于0.5 ml FCA的含10%OVA的0.9%氯化钠注射液5 ml。第15天时，将上述两组大鼠放置于雾化箱中，给予8周的1%OVA雾化吸入（隔天吸入1次，每次30 min），激发哮喘。罗红霉素组大鼠在每次激发前30 min，给予罗红霉素灌胃，剂量为30 mg/kg；而对照组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.2.2 标本采集 末次气道激发24 h后，腹腔注射苯巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，从腹主动脉采血3 ml，2 500 r/min离心15 min，留取上层血清。将大鼠左侧支气管进行结扎，用无菌0.9%氯化钠注射液进行左肺支气管肺泡灌洗，收集灌洗液，1 500 r/min离心10 min，留存上清液，灌洗液离心后的沉渣用于细胞计数。取大鼠右肺上叶组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，进行连续切片，厚度为4 m。

1.3 检测指标（1）哮喘评分：0分：活动灵活，没有出现呼吸急促；0.5分：呼吸急促但并未伴腹式呼吸；1分：呼吸困难；2分：呼吸困难并伴有咳嗽；3分：深入呼吸、张口呼吸、口耳鼻发绀；4分：休克死亡[8]。（2）肺泡灌洗液中细胞计数：肺泡灌洗液1500 r/min离心10 min，沉淀细胞经处理后取细胞悬液，经瑞氏-吉姆萨染色后显微镜下进行细胞分类计数，包括中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、淋巴细胞计数和单核细胞计数。每张切片在显微镜400倍视野下进行观察，取5个视野，每视野分类计数200个细胞，计算炎症细胞所占比例。（3）支气管肺组织病理学观察：将石蜡切片脱蜡至水，随后进行苏木素染色和伊红染色（HE染色），最后脱水封片。用显微镜观察大鼠肺组织病理形态学变化。显微镜下放大200倍，选取20个完整的支气管横断面，用Image-Pro Plus 6.0软件测量基底膜周径（Pbm）、支气管总管壁面积（WAt）、气道内壁面积（WAi）及平滑肌面积（WAm），为消除管径、气道状态和切片方向等造成的误差，用Pbm将上述测量值标准化。以总管壁厚度（WAt/Pbm）、内壁厚度（Wai/Pbm）和平滑肌厚度（WAm/Pbm）判断气道重塑程度[9]。（4）酶联免疫吸附试验检测血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25水平：严格按照试剂盒说明书进行操作，检测S100A9、IL-17和IL-25水平，酶标仪波长设置为450 nm。（5）免疫组织化学染色法检测大鼠肺组织S100A9蛋白表达：经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、枸橼酸溶液抗原修复后，聚乙二醇辛基苯基醚通透，用3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，随后用山羊血清封闭。滴加S100A9一抗（1∶500），孵育过夜。用DAB显色，苏木精复染。梯度酒精脱水，二甲苯溶液透明，中性树胶封片。显微镜下进行观察，棕黄色为表达阳性。用Image Pro Plus 6.0软件分析平均光密度。

1.4 统计方法 采用SPSS20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况 对照组大鼠精神状态良好，毛色正常，呼吸均匀。模型组大鼠首次激发后，表现出呼吸急促、呼吸节律不规则及烦躁不安；多次激发后呼吸症状加重，体质量稍下降，毛色不光泽。罗红霉素组大鼠呼吸症状较模型组减轻。对照组和罗红霉素组哮喘评分分别为（0.34±0.12）分和（1.25±0.08）分，均低于模型组的（3.02±0.99）分（F=20.001，P＜0.05）。

2.2 各组肺泡灌洗液中细胞计数比较与模型组比较，对照组中性粒细胞计数和嗜酸性粒细胞计数明显增高（均P＜0.05），而淋巴细胞计数和单核细胞计数明显下降（均P＜0.05）。与模型组比较，罗红霉素组中性粒细胞计数和嗜酸性粒细胞计数明显降低（均P＜0.05），而淋巴细胞计数和单核细胞计数明显增高（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组肺泡灌洗液中细胞计数比较 %

2.3 病理学观察 对照组大鼠支气管壁完整，管腔规则，基地膜较薄，未见炎症性改变。模型组大鼠支气管、肺间质、肺泡腔中有大量炎细胞浸润，支气管皱襞较多，并且气管壁增厚，管腔变窄（封二彩图3），镜下可见黏膜上皮细胞的脱落和坏死；罗红霉素组大鼠的病理表现较模型组轻。与对照组比较，模型组WAt/Pbm、Wai/Pbm和WAm/Pbm明显增高（均P＜0.05）；与模型组比较，上述指标明显降低（均P＜0.05）。见表2。

2.4 血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25的表达水平 与对照组比较，模型组血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25表达水平较高（均P＜0.05）；与模型组比较，罗红霉素组上述指标表达水平较低（均P＜0.05），见表3。血清中S100A9分别与IL-17、IL-25呈正相关（r=0.797、0.493，均P＜0.05）；肺泡灌洗液中S100A9也分别与IL-17、IL-25呈正相关（r=0.858、0.708，均P＜0.05）。

表3 血清和肺泡灌洗液中S100A9、IL-17和IL-25的表达水平 ng/L

2.5 肺组织S100A9的表达 免疫组织化学染色显示S100A9表达于上皮细胞、平滑肌细胞、粒细胞胞质，阳性表达呈棕黄色（封二彩图4）。模型组S100A9平均光密度值为（0.27±0.09），高于对照组的（0.02±0.05）（P＜0.05），罗红霉素组 S100A9平均光密度值为（0.09±0.02），低于模型组（P＜0.05）。

3 讨论

中性粒细胞哮喘的发病机制尚未完全明确，可能涉及免疫炎症损伤、气道高反应性和气道重塑[10]。因此，阐明中性粒细胞性哮喘的发病机制具有重要意义。S100家族包含20多个成员，S100A9定位于人染色体q21上，具有抑制酪氨酸激酶活性[3]。S100A9能够诱导中性粒细胞的趋化和黏附，在肿瘤、心血管疾病、风湿性疾病及感染性疾病中起到重要作用[4,11-13]。周四芳等[14]发现，诱导痰中性粒细胞S100A8/A9表达水平与儿童哮喘的病情严重程度和布地奈德治疗效果有关。以上提示S100A9可能在中性粒细胞哮喘中发挥重要作用。本研究模型组中性粒细胞计数、气道重塑指标和炎症指标明显增高。与对照组比较，模型组大鼠血清和肺泡灌洗液中S100A9均较高，这提示S100A9可能参与了中性粒细胞哮喘的发生。Kim等[15]研究发现，S100A9可以通过促进支气管上皮细胞因子分泌，抑制中性粒细胞凋亡，进而参与哮喘进展。气道重塑是哮喘重要的病理变化，本研究以WAt/Pbm、Wai/Pbm和WAm/Pbm来判断气道重塑程度，模型组上述指标明显增高，与文献[16]报道一致。IL-17和IL-25在中性粒哮喘中起到重要作用，与气道重塑和哮喘严重程度密切相关[17-18]。本研究发现血清和肺泡灌洗液中血清中S100A9分别与IL-17和IL-25呈正相关，这说明S100A9可能参与了中性粒细胞哮喘的气道重塑。

本课题组前期发现罗红霉素可以通过抑制微囊蛋白-1和磷酸化p42/p44原蛋白激活蛋白激酶，抑制哮喘大鼠的气道重塑[19]；另外，还能抑制哮喘大鼠的气道平滑肌增殖[6]。微囊蛋白-1和磷酸化p42/p44原蛋白激活蛋白激酶可能影响了S100A9的活性[6]。笔者推测罗红霉素可能是通过S100A9而发挥作用。本研究结果显示与模型组比较，罗红霉素组S100A9、IL-17和IL-25表达水平明显下降，血清和肺泡灌洗液中S100A9分别与IL-17和IL-25呈正相关。这提示罗红霉素可能通过S100A9发挥抗炎和调节气道重塑作用。

综上所述，本研究证实S100A9在中性粒细胞哮喘的气道炎症和气道重塑中可能起到重要作用，罗红霉素可能通过抑制S100A9表达发挥治疗哮喘的作用。未来需要进一步分析S100A9的具体生物学机制，开展临床实验，分析S100A9在中性粒细胞哮喘诊断和治疗中的作用。