宁波地区新生儿G6PD缺乏症基因突变特点及与酶活性的相关性分析

庄丹燕，王飞，潘婕文，潘小莉，潘澍青，陈志央，李海波

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（G6PDD）是一种因编码G6PD酶的DNA突变使该酶结构或其活性发生改变，最终影响红细胞自身抗氧化能力减弱，易被破坏引发溶血黄疸等一系列症状的X连锁不完全显性遗传病[1]。G6PD基因突变类型和频率因地区种族人群差异较大，常见于非洲热带、东南亚、地中海和中东区域[2]，我国则以南方地区为主[3]。G6PD酶法检测受性别、温度等影响较大[4-5]。本研究针对2018年宁波地区出生的新生儿，行G6PD缺乏症酶法筛查及基因诊断，以评估G6PD缺乏症在宁波地区的发病情况，明确宁波地区人群的G6PD基因突变类型和频率，同时分析基因型与酶活性相关性，为宁波市筛查中心制定本地区最佳的G6PD缺乏症筛查及确诊方案提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集宁波市2018年出生的新生儿78 338名，每例新生儿家长均签署知情同意书自愿参加免费新生儿疾病筛查。采其足跟血制成干血斑用于筛查，筛查阳性样本（酶活性≤2.6 U/g Hb）进行基因确诊，同一筛查时间段内酶活性介于2.6～3.0 U/g Hb的女性样本也纳入基因检测。

1.2 方法

1.2.1 G6PD初筛实验 采用Wallac 1420 VictorTM2及配套G6PD荧光分析试剂盒对新生儿干血斑进行初筛，试验步骤和结果判读严格按照试剂说明书执行。

1.2.2 G6PD/6GPD生化比值检测 筛查可疑阳性的患儿召回抽取患儿抗凝血，采用G6PD/6GPD试剂盒（广州米基）进行确诊，G6PD/6GPD＜1视为确诊G6PD缺乏。

1.2.3 G6PD基因检测 采用Lab-Aid824核酸提取仪（厦门致善）提取干血斑标本中基因组DNA，用SLAN-96S实时PCR系统（上海宏石）进行多色探针荧光PCR熔解曲线分析。通过比较待检标本与野生型对照的熔解峰之间熔点（Tm值）的差异判断标本是否发生突变及突变的类型。如果没有发现热点突变，则对G6PD编码外显子进行Sanger测序（NM_001042351.1）。

1.3 统计方法 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，计数资料采用2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宁波地区G6PD基因突变类型和频率 78 338例新生儿G6PD筛查中，酶活性≤2.6 U/g Hb的阳性例数405例，介于2.6～3.0 U/g Hb之间的女性95例，共500例样本纳入基因检测。检测结果220例未见突变，280例检出不同位点突变，以1388G＞A突变占比最多（86例，占30.71%，含72例纯合突变和14例杂合突变），其次为1376G＞T（77例，占27.50%，含55例纯合突变和22例杂合突变）。其中c.1375C＞T、c.350C＞T两个突变，MMCA检测结果为未知基因，Sanger测序后发现为这两个突变。见表1、封三彩图7。

表1 不同基因突变位点和频率统计

2.2 基因突变携带率在不同G6PD酶活性区间分布情况 经基因检测的500例样本，其中男290例，女210例。当G6PD酶活＞2.4 U/g Hb时，男性样本突变携带率＜20%；而女性高达20%～50%。见封三彩图8。

2.3 G6PD基因型与酶活相关性 比较5种最常见基因突变位点样本G6PD酶活性差异，不同基因突变位点样本G6PD初筛浓度值差异有统计学意义（2=8.713，P＜0.05）；95A＞G突变类型G6PD初筛＞2.6 U/g Hb的比例均高于1376G＞T（2=5.377，P＜0.05），见表2。

表2 不同基因突变位点样本G6PD初筛值比较 例（%）

3 讨论

3.1 G6PD基因突变类型和频率G6PD是一种细胞溶质酶，在胞浆内和细胞膜上均有分布，几乎所有哺乳动物细胞中都含有G6PD。人类编码G6PD酶的DNA序列由13个外显子、12个内含子组成，位于X染色体端粒附近，其完整序列长达16.2Kb[6]。G6PD基因突变以点突变为主,世界范围已报道400多种突变[7]。我国以c.1388G＞A、c.1376G＞T及c.95A＞G突变为主[8]。本研究发现，宁波地区最常见的前3位基因突变类型为c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.1024C＞T，共占75%；另外c.95A＞G、c.871G＞A和c.392G＞T基因在宁波地区也有较高发生率，分别占10.36%、5.36%及3.21%，与海南省报道的相似[9]。虽然本研究与温州地区报道的c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.1024C＞T前3位略有不同[10]，但前6位主要突变类型还是基本一致的。本研究还发现3例复合突变：1360C＞T与1388G＞A、95A＞G与1024C＞T、95A＞G与1388G＞A。这3例复合突变均发生于G6PD活性缺乏的女性，这提示该突变可能是双杂合子，需进一步需完善父母基因检测结合家系判定结果。

另外，在初筛阳性样本中检出两例未知突变，经基因测序发现是c.1375C＞T、c.350C＞T突变各1例，均未见报道。经数据库查询，c.350C＞T突变为第5号外显子350位置C替换成T，导致氨基酸功能发生改变，丝氨酸转换成苯丙氨酸；c.1375C＞T突变为第13号外显子1375位置C替换成T，精氨酸转换成半胱氨酸，均为错义突变。

3.2 G6PD基因型与酶活相关性G6PD缺乏症的遗传方式是一种伴性不完全显性遗传，男性患儿只有半合子，其多表现为酶活性显著缺乏，而女性因为有两条X染色体，故可有纯合子和杂合子2种。纯合子表现为酶活性严重缺乏，杂合子因X染色体存在随机失活现象，体内可同时存在酶缺乏和正常两种红细胞，且两者分布并不均[11]，可表现为酶活性正常或仅轻度降低。本研究显示，G6PD酶活＞2.4 U/g Hb时，男性样本突变携带率＜20%，而女性高达20%～50%。可见，G6PD基因有突变携带的男性酶活性分布在2.4 U/g Hb以下居多；女性酶活性高至3.0 U/g Hb突变携带率才降至20%左右。假如不同性别使用同一酶活切值去界定阳性人群，则会导致绝大多数女性杂合子漏筛或男性出现过多假阳性，因此需要对不同性别分设不同阳性截断值。

本研究结果显示，871G＞A和95A＞G突变类型，其G6PD初筛＞2.6 U/g Hb的比例显著高于1376G＞T，这说明该种突变相对1376G＞T，酶活性下降程度较低；而其他4种位点突变酶活性下降程度较高，后续可进一步进行挖掘探讨。

3.3 宁波地区筛查诊断模式探讨 由于G6PD缺乏症不完全显性的特性及突变分布的差异，不同省份对G6PD缺乏症的检出存在差异。本研究结果表明，宁波的G6PD新生儿人群突变携带率达0.36%（280/78338），低于海南、广东等高发地区[10,12]，与本省温州地区相似[9]，略高于温州的0.3%。宁波地区处于长江以南，随着近年城市化进程加快，人口流动日益频繁等因素，本地区的G6PD发病也确实不容忽视。G6PD缺乏症一旦发病病情严重，只能对症治疗，通过新生儿筛查及基因诊断可起到早诊断早预防的效果，并且对女性杂合子的检出可进一步指导生育。对于G6PD缺乏症的筛查诊断防治本研究提供了一定依据，也为后续基因型和表型相关研究提供了基础。