食品安全风险监测中致泻性大肠埃希氏菌PFGE 的应用价值分析

何旭鑫，次仁卓玛，史二丽，陈洲斯，杨 洋，吉 拉，巴桑拉姆

（1 承德市疾病预防控制中心 河北 承德 067000）

（2 阿里疾病预防控制中心 西藏 阿里 859000）

大肠埃希氏菌又叫大肠杆菌（Escherichia coli），是Escherich 在1885 年人类和动物的肠道里发现的，其生存条件广泛。生活在肠道里的大肠埃希氏菌属于正常寄居性菌群，而且还能合成V i t B 和K 产生大肠菌素，是不可缺少单细胞生物体。当机体抵抗力下降或侵入肠外组织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外的感染[1]。主要表现为人体和多种动物的胃肠道感染、尿路炎症、败血症、关节炎、脑膜炎等多种局部器官组织发生病变，常见疑似引起发生食源性食物中毒的食品包括熟肉制品、蛋制品、凉菜、牛乳、蔬菜、水果等，因此加强对大肠埃希氏菌的致病性及检测方法的研究，加强食品中致泻性大肠埃希氏的监测对食品安全风险监测及防控具有重要意义。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）是一种基于分子水平的分型方法，是一种分离大分子DNA 或者染色体的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA 分子（＞10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA 分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10 kb 到10 Mb 的DNA 分子。近年来被广泛应用于疾病预防控制现场流行病学分析调查研究[2-3]。PFGE 具有效果性好，敏感力强，被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”，已广泛应用于分子流行病学研究，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪传染源，在疫情控制方面发挥着重要的作用。本文主要对近年在食品中分离的致泻性大肠埃希氏菌进行基因分型和流行病分析。通过对致泻性大肠埃希氏菌的毒力基因和PFGE 的基因分析，以达到对食品中致泻性大肠埃希氏菌的流行状况及传染源的追踪进行判断，对防治和减弱致泻性大肠埃希菌的爆发提供有效数据。

1.材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1监测依据 根据《中华人民共和国食品安全法》（以下简称《食品安全法》）和《河北省卫生部门食品安全风险监测方案》的要求，掌握我市市售食品中主要污染物及有害因素的污染指标和方向，明确导致危害因素的分布和疑似来源，收集和分析主要食源性疾病的发病及流行趋势，为开展食品安全风险评估和标准制定、修订及跟踪评价等工作提供有效保障。发现食源性疾病安全隐患，及时通报食品安全相关监管部门，采取适当的风险预警和监管严查[4]。

1.1.2 采样要求 常规监测。以获得连续性、代表性数据为目的，了解大宗食品中食源性疾病有害因素的污染情况、污染趋势和地域分布，并为食品安全风险评估、标准制定、修订及跟踪评价提供数据。风险监测包含食品中重金属元素、生物毒素、农药残留等，监测产品包含水产及其加工品、蔬菜及其制品、肉与肉制品等。专项监测。以发现食品安全隐患及线索、对发现的食品安全问题进行溯源为目的，包括两种类型，一是针对特定食品的探索性、针对性监测，对可疑存在的食品安全风险问题并给食品安全监督管理提供可靠证据；二是针对生产加工过程的监测，发现可能存在的污染源，为标准（生产加工规范）的制定、修订及跟踪评价提供数据。本市及各县区采集本地产样品的数量应不低于方案任务量90%，尽可能全包含市售所有定性包装和散装食品，优先考虑本地生产的品类。要综合判断承德市食品生产加工和居民消费等实际原因，规范合理的研究采样程序方案，避免集中采样，样品采集应覆盖我市八县三区超市、市场及乡村零售店、点，采样点和采样时间要保持相对固定。要严格按照监测方案开展监测，不得擅自变更监测食品类别、监测时间、采样地点等，做好质量控制，保证监测数据真实、准确，按时上报监测数据。

1.1.3 菌株来源 2018 年3 月—2019 年12 月食品污染物监测中分离并保存的19 株致泻性大肠埃希氏菌株。致泻性大肠埃希氏菌株由河北省疾控中心细菌病防治与消毒所提供。

1.2 检验项目

致泻性大肠埃希氏菌、五种（EPEC、ETEC、EIEC、EAEC、EHEC）致泻性大肠埃希氏菌毒力基因检测、PFGE。

1.2.1 主要仪器 恒温培养箱、核酸提取仪、ABI7500 荧光定量PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪。

1.2.2 主要试剂 江苏硕世五种致泻大肠埃希氏菌反应体系试剂盒、血平板、PFGE 专用琼脂糖（Seakem Gold Agarose）为美国 Lonza 公司产品；细胞悬浮液（CSB）和细胞裂解液（CLB）均为新鲜配制。

1.3 方法

1.3.1 培养好的细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。PFGE 中内切酶的选用是非常关键的一步，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），酶切后的片段少而大，适合于作PFGE 电泳。所试验的19 个细菌的染色体中，被1 个或多个可识别CTAG 位点的内切酶酶切，每100000bps 中不到一次，所产生酶的识别序列分别为：Xba Ⅰ（TCTAGA），Sep Ⅰ（ACTAGT），Avr Ⅱ（CCTAGG）和Nhe Ⅰ（GCTAGC）。同样地，在许多含G+C<45% 的基因组，CCG 和CGG 更 少。这样用Sma Ⅰ（CCCGGGG）、R sr Ⅱ（CGGWCGG）、Nae Ⅰ（GCCGGC）和Sac Ⅱ（CCGCGG）进行酶切，产生平均超过100000bps 片段.

1.3.2 毒力基因检测 依据江苏硕世的试剂盒对五种致泻进行检测。

1.3.3 PFGE 分型 PFGE 的操作方法按照中国疾病预防控制中心提供的标准方法进行[8]，PFGE 电泳图谱用Bio Numerics 进行软件分析。

2.结果

2.1 毒力基因结果

19 株致泻性大肠埃希氏菌结果为4 株ETEC、7 株EPEC、8 株EAEC。

2.2 PFGE 结果

从图1 中可以看出 CD109、CD113，CD145、CD197，CD042、CD136 等相似数均＞90%。结合样品的采集地点和采集种类分析、以上样品均为一个品种、来源于一个采集地点。

图1 PFGE 结果图

3.讨论与分析

传统的细菌表型分型易受环境因素和菌株变异的影响，且实验室重复性和灵敏度等指标也不能满足现代疾病预防控制的要求[5]。随着分子分型生物科学技术的发展，PFGE 在菌株鉴定分型、同源性追踪、传染病病原溯源及流行病调查等方面发挥着越来越重的作用[6]。

本次实验中19 株致泻性大肠埃希氏菌，经五种致泻大肠埃希氏菌荧光PCR 检测，检验结果为4 株ETEC、7株EPEC、8 株EAEC。PFGE 溯源检测分析CD109、CD113，CD145、CD197，CD042、CD136 等相似数均＞90%，属同一克隆体系。结合食品样品的采集地点、与采集种类分析。以上样品均来自同一采集地点和同一品种。说明致泻性大肠埃希氏菌的优势株已存在于本地区、在食品加工、销售、运输环节存在纰漏、使某一地点和相邻地点的同一品种增加了致泻性大肠埃希氏菌的感染机会[7]。因此，卫生监督管理机构应该注重平时执法监督、加强对从业人员的健康宣传教育、从源头上减少或杜绝食品安全问题的发生。通过此项目的开展可以证实PFGE 可实现菌株有效鉴别和溯源、对已检测出的疫情暴发原因进行传染源跟踪调查、预防同源性食源性疾病的再次发生等工作中具有重要的意义[8]。