幽门螺杆菌感染性胃癌组织microRNA-17、microRNA-490-3p的表达及其与临床病理特征和预后的关系

李丽萍，贾筠

（东莞市人民医院肿瘤内科，广东东莞523000）

胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。我国胃癌的发病率和病死率均较高，已成为威胁人民生命健康的公共卫生问题[1]。胃炎、胃溃疡、不典型增生、癌前病变和胃癌的疾病演进过程中，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）均发挥关键作用[2]，探讨Hp 阳性胃癌的发生、发展机制，寻找新的治疗、预后预测标志物，对延长Hp 阳性胃癌患者的生存时间有重要意义。

MicroRNA 成为研究肿瘤靶向治疗的新方向。研究证实，胃癌发生、发展过程中涉及多种microRNA 异常表达[3]。姜双等[4]发现胃癌组织中microRNA-17（miR-17）呈高表达，但miR-17 在Hp阳性胃癌中的表达及其与患者预后的关系研究甚少；microRNA-490-3p（miR-490-3p）作为抑癌因子，在消化系统肿瘤中发挥作用，如miR-490-3p 表达降低可减弱细胞克隆形成能力、抑制细胞增殖[5]，沉默miR-490-3p 表达可促进Hp 阳性胃癌的恶性进展。本研究探讨miR-17、miR-490-3p 在Hp阳性胃癌组织中的表达及其与肿瘤进展、预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月—2014年6月东莞市人民医院收治的行手术切除的胃癌患者146 例，收集其胃癌组织及癌旁组织。根据Warthin-Starry 银染结果，Hp阳性胃癌患者97 例（62 例患者接受抗Hp 治疗，35 例患者未接受抗Hp 治疗），Hp 阴性胃癌患者49 例。Hp 阳性胃癌患者中，男性62 例，女性35 例；年龄26～76 岁，平均（49.57±10.34）岁。Hp 阴性胃癌患者中，男性31例，女性18例；年龄24～78岁，平均（50.42±11.45）岁。Hp 阳性胃癌患者与Hp 阴性胃癌患者的年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究以患者出院为起点，对患者进行为期1～60 个月随访。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者家属签署知情同意书。纳入标准：具有完整的病历资料和随访资料，术前未接受放化疗，经病理检查确诊。排除标准：合并其他恶性肿瘤，合并糖尿病等慢性疾病。

1.2 试剂与仪器

Trizol 试剂（购自美国赛默飞世尔科技公司），Applied BiosystemTMSYBRTM试剂盒（购自美国应用生物系统公司），微量紫外分光光度计（购自美国赛默飞世尔科技公司），实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪（购自美国应用生物系统公司）。

1.3 qRT-PCR检测miR-17、miR-490-3p mRNA的相对表达量

切取0.1 g 胃癌组织及癌旁组织的组织标本至小烧杯内，剪碎组织块后，转移至玻璃匀浆管中，上下转动研磨，充分研碎。取100 μl 组织匀浆至EP 管中，加入900 μl Trizol 试剂，依次加入氯仿、异丙醇、无水乙醇，提取组织总RNA，微量紫外分光光度计检测RNA 纯度和浓度。采用Applied BiosystemTMSYBRTM试剂盒，配制qRT-PCR 反应体系，反应条件：95℃预变性20 s，95℃变性10 s；60℃退火20 s；70℃延伸10 s；共40 个循环。以U6为内参。miR-17 引物序列，正向：5'-GATAACAGG CAAGCTTTGAGG-3'，反向：5'-CTGCAAAGATTGTT TGCGAGA-3'；miR-490-3p 引物序列，正向：5'-GCAAACAACCAUUCGGCUGUC-3'，反向：5'-CGCA GGTCCGGAGTAGGT-3'；U6引物序列，正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCA CGAATTTGCG-3'。2-ΔΔCt法计算miR-17、miR-490-3p mRNA 相对表达量。重复实验3 次。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或方差分析；相关分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 绘制生存曲线，比较采用Log-rank χ2检验；影响因素的分析采用多因素Cox 回归模型。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织miR-17、miR-490-3p mRNA 相对表达量比较

Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17 mRNA 相对表达量与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P<0.05），癌组织高于癌旁组织；Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-490-3p mRNA 相对表达量与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P<0.05），癌组织低于癌旁组织（见表1）。Hp 阴性胃癌患者癌组织miR-17 mRNA 相对表达量与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P<0.05），癌组织高于癌旁组织；Hp 阴性胃癌患者癌组织miR-490-3p mRNA 相对表达量与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P<0.05），癌组织低于癌旁组织（见表2）。

表1 Hp阳性胃癌患者癌组织与癌旁组织miR-17、miR-490-3p mRNA相对表达量的比较 （n=97，±s）

表1 Hp阳性胃癌患者癌组织与癌旁组织miR-17、miR-490-3p mRNA相对表达量的比较 （n=97，±s）

组别miR-17 mRNA miR-490-3p mRNA癌组织癌旁组织t 值P 值4.695±1.528 1.642±0.419 18.978 0.000 0.518±0.327 1.439±0.368-18.426 0.000

表2 Hp阴性胃癌患者癌组织与癌旁组织miR-17、miR-490-3p mRNA相对表达量的比较 （n=49，±s）

表2 Hp阴性胃癌患者癌组织与癌旁组织miR-17、miR-490-3p mRNA相对表达量的比较 （n=49，±s）

组别miR-17 mRNA miR-490-3p mRNA癌组织癌旁组织t 值P 值2.647±1.347 1.724±0.427 4.572 0.000 0.792±0.416 1.527±0.391-9.012 0.000

2.2 不同胃癌组织miR-17、miR-490-3p mRNA表达的相关性

经Pearson相关分析，在Hp 阳性胃癌组织中miR-17和miR-490-3p mRNA的表达无相关性（r=-0.056，P=0.585），在Hp 阴性胃癌组织中，miR-17和miR-490-3p mRNA 的表达无相关性（r=-0.134，P=0.360）。见图1。

图1 Hp阳性及Hp阴性胃癌组织miR-17、miR-490-3p mRNA表达的散点图

2.3 不同临床病理特征Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17、miR-490-3p mRNA相对表达量的比较

不同肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移及TNM 分期的Hp阳性胃癌患者癌组织miR-17 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）；不同年龄、性别、分化程度、浸润深度、病理类型的Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17 mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。不同肿瘤直径、淋巴结转移及远处转移的Hp阳性胃癌患者癌组织miR-490-3p mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）；不同年龄、性别、分化程度、浸润深度、病理类型、TNM分期Hp阳性胃癌患者癌组织miR-490-3p mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 不同临床病理特征Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17、miR-490-3p mRNA 相对表达量的比较 （±s）

表3 不同临床病理特征Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17、miR-490-3p mRNA 相对表达量的比较 （±s）

临床病理特征年龄<60岁≥60岁性别n miR-17 mRNA t/F 值P 值miR-490-3p mRNA t/F 值P 值56 41 4.859±1.628 4.471±1.427 1.221 0.113 0.571±0.321 0.519±0.331-0.030 0.488男女62 35 4.761±1.729 4.578±1.547 0.519 0.302 0.531±0.362 0.495±0.317 0.491 0.312肿瘤直径<5 cm≥5 cm分化程度低分化中、高分化浸润深度黏膜下层浆膜层病理类型腺癌印戒细胞癌黏液癌淋巴结转移49 48 4.324±1.347 5.073±1.749-2.366 0.010 0.581±0.394 0.454±0.295 1.794 0.038 38 59 4.627±1.476 4.739±1.605-0.346 0.365 0.522±0.332 0.515±0.317 0.104 0.549 58 39 4.719±1.527 4.659±1.634 0.184 0.427 0.508±0.317 0.533±0.328-0.376 0.354 76 19 2 4.721±1.637 4.624±1.527 4.385±1.468 0.066 0.936 0.517±0.329 0.521±0.331 0.528±0.308 0.002 0.998是否48 49 5.137±1.829 4.262±1.507 2.574 0.006 0.460±0.302 0.575±0.362-1.697 0.046远处转移是否43 54 5.087±1.811 4.382±1.479 2.111 0.019 0.451±0.311 0.571±0.352-1.755 0.041 TNM分期Ⅰ、ⅡⅢ、Ⅳ65 32 4.475±1.527 5.142±1.726-1.937 0.028 0.526±0.329 0.502±0.314 0.343 0.366

2.4 miR-17、miR-490-3p表达与Hp阳性胃癌患者生存预后的关系

以miR-17 mRNA 相对表达量的中位数（4.249）为界，将Hp 阳性胃癌患者分为miR-17 低表达Hp阳性胃癌组（48 例）和miR-17 高表达Hp 阳性胃癌组（49 例）。miR-17 低表达Hp 阳性胃癌组的术后5年生存率为47.92%（23/48），术后中位生存时间为40.67 个月；miR-17高表达Hp阳性胃癌组的术后5年生存率为20.41%（10/49），术后中位生存时间为32.22 个月。两组5年生存率比较，差异有统计学意义（χ2=6.225，P=0.013）。以miR-490-3p mRNA 相对表达量的中位数（0.509）为界，将Hp 阳性胃癌患者分为miR-490-3p 低表达Hp 阳性胃癌组（48 例）和miR-490-3p 高表达Hp 阳性胃癌组（49 例）。miR-490-3p 低表达Hp 阳性胃癌组的术后5年生存率为20.83%（10/48），术后中位生存时间为29.42 个月；miR-490-3p 高表达Hp 阳性胃癌组的术后5年生存率为46.94%（23/49），术后中位生存时间为42.74个月。两组5年生存率比较，差异有统计学意义（χ2=10.781，P=0.001）。见图2。

图2 不同miR-17、miR-490-3p表达Hp阳性胃癌患者的生存曲线

2.5 影响Hp阳性胃癌患者预后的危险因素

以Hp 阳性胃癌患者为样本（n=97），患者预后为因变量（死亡=1，存活=0，生存期：t），肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期、miR-17 表达、miR-490-3p 表达为自变量，以miR-17 mRNA相对表达量的中位数（4.249）、miR-490-3p mRNA相对表达量的中位数（0.509） 为界进行分层，miR-17、miR-490-3p 表达转化成两分类变量，纳入多因素Cox 回归模型，采用逐步后退法，以行自变量的选择和剔除（α入=0.05，α出=0.10）。结果：有远处转移[H^R=2.824（95% CI：2.700，2.984）]、较高的TNM 分期[H^R=1.793（95% CI：1.703，1.883）]、miR-17 高表达[H^R=2.517（95% CI：2.391，2.643）]和miR-490-3p 低表达[H^R=1.579 （95% CI：1.550，1.608）]是影响Hp 阳性胃癌患者预后的危险因素（P<0.05）。见表4。

表4 Hp阳性胃癌患者预后影响因素的多因素Cox回归模型参数

3 讨论

miR-17-92 基因簇是定位于染色体13q31 的多顺反子miRNA 基因，在人类肿瘤中表达最广泛，可促进细胞增殖、细胞周期进程、细胞侵袭迁移等，主要包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92 共6 种miRNA[6]。目前发现，miR-17-92 基因簇与血管异常及冠状动脉疾病相关[7]，降低miR-17 有助于改善血管功能[8]，而miR-17 高表达则会引起冠心病患者术后血管再狭窄的形成。

研究表明，胃癌患者血清miR-17 表达升高，且过表达miR-17 可促进胃癌细胞增殖[9-10]。miR-17具有作为胃癌诊断靶标的潜能[11-12]。本研究发现Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17 mRNA 相对表达量较癌旁组织升高，且在肿瘤直径≥5 cm、有淋巴结转移、有远处转移及高TNM 分期的Hp 阳性胃癌患者癌组织中相对表达量升高，提示miR-17 可能通过促进细胞增殖、侵袭加速病情恶化。ZHANG等[13]研究证实miR-17 可调节UBE2C基因表达，参与胃癌细胞增殖调控。miR-17 通过死亡效应结构域DNA 结合蛋白（death effector domain DNA-binging protein,DEDD）依赖的机制，参与胃癌细胞的上皮间质转化过程[14]。NOORMOHAMMAD 等[15]证实miR-222 在Hp 阳性及Hp 阴性胃癌组织中的表达差异无统计学意义，提示miR-222 表达可能与Hp 感染无关。miR-17 表达是否与Hp 感染有关，其具体分子机制仍需深入探究。

miR-490-3p 作为抑癌因子，能显著抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡[16]，在结肠癌组织中低表达[17]。本研究结果发现Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-490-3p mRNA 相对表达量较癌旁组织降低，且在肿瘤直径≥5 cm、有淋巴结转移及有远处转移的Hp 阳性胃癌患者癌组织中相对表达量降低，表明miR-490-3p 在胃癌细胞增殖、侵袭转移的分子调控中发挥作用。SHEN 等[18]的研究证实，表观沉默miR-490-3p 可诱导Hp 感染性胃癌形成。研究证实，Hp 可降低miR-141 表达，进而诱发胃癌细胞化疗耐药[19]，Hp 感染导致miR-203 表达下降，促进胃癌细胞增殖、侵袭[20]。笔者分析Hp 感染可能导致miR-490-3p 表观沉默，降低miR-490-3p 表达，调控下游基因表达，如AKT1基因[21]，进而参与胃癌细胞增殖、侵袭等过程调控。

本研究结果发现，miR-17 高表达Hp 阳性胃癌组及miR-490-3p 低表达Hp 阳性胃癌组患者的术后5年生存率及中位生存时间均较差，提示miR-17高表达、miR-490-3p 低表达均与患者不良预后有关；进一步Cox 回归分析结果表明，miR-17 高表达、miR-490-3p 低表达是影响胃癌患者预后的危险因素，提示检测癌组织miR-17、miR-490-3p 表达，可能有利于预测和评估患者预后。

此外，笔者分析，miR-17 与miR-490-3p 除可能通过调控胃癌细胞增殖、侵袭迁移参与胃癌病情恶化外，可能还与患者术后化疗相关，如下调miR-17 表达增强口腔癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性[22]，miR-17 表达上调与提高套细胞淋巴瘤[23]、非小细胞肺癌等[24]肿瘤细胞放射抗拒相关，上调miR-490-3p 可降低耐药蛋白表达及抑制P-gp 活性，逆转乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性[25]。本研究未针对miR-17、miR-490-3p 表达与胃癌患者术后化疗耐药性的关系进行研究，后续将继续探讨miR-17、miR-490-3p 表达与患者术后放化疗疗效及耐药性的关系，并探究miR-17、miR-490-3p 表达对患者术后化疗方案选择的指导作用。

综上所述，本研究发现Hp 阳性胃癌患者癌组织miR-17 表达增加而miR-490-3p 表达降低，且均可能参与Hp 阳性胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等过程；miR-17 高表达、miR-490-3p 低表达是影响Hp阳性胃癌患者预后的危险因素，均与患者不良预后有关，监测癌组织miR-17、miR-490-3p 表达可能有利于患者的预后判断。但本研究未对血清样本进行miR-17、miR-490-3p 表达的检测，后续可做进一步研究。