胆道闭锁患儿血清microRNA-21水平的表达及与肝纤维化的相关性分析*

宫颖新，王萍，白玉坤，张桂枝，焦晗亮，刘伟栋，李杨，祁艳卫

（河北省儿童医院普外二科，河北石家庄050031）

胆道闭锁是新生儿、婴幼儿出现阻塞性黄疸的最主要病因之一，具体病理表现为肝内外胆管进行性炎症及纤维性梗阻，随病情持续进展后续可出现肝纤维化、肝硬化，严重可导致小儿死亡[1-3]。胆道闭锁患儿行手术治疗的预后差异较大，故对其发病机制、防治手段等探索具有重要的临床意义。microRNA 是一类高度保守的小分子，参与细胞增殖、分化、胚胎发育、信号传导等多个生命过程，且在肿瘤发生过程中也扮演重要角色。有研究[4]指出microRNA 在胆道闭锁的发生中扮演重要角色。且AFONSO[5]等研究发现，microRNA-21（miR-21）消融术可预防胆汁淤积症患者的肝损伤和坏死。胆道闭锁患儿胆汁淤积严重，但国内关于miR-21 在胆道闭锁病程中扮演角色的研究极少。本文探讨胆道闭锁患儿血清中miR-21 的表达水平，并分析其具体表达量与肝纤维化的内在联系，旨在明确miR-21 对胆道闭锁病情进展的影响，并为后续疾病治疗干预等提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年7月—2019年7月河北省儿童医院收治的先天性胆道闭锁患儿76 例作为胆道闭锁组。其中，男性36 例，女性40 例；年龄1～6 个月，平均年龄（3.17±0.49）个月。纳入标准：①均经葛西探查、胆道造影及病理确诊为胆道闭锁；②符合手术指征，既往无相关治疗史。排除标准：①合并先天性心脏病等其他严重先天性疾病；②合并基础性肝脏病变。选取同期在本院进行体检的健康婴幼儿50 例作为正常对照组，各项检查结果均在正常范围内、未合并明显先天性疾病，其监护人签署知情同意书。其中，男性23 例、女性27 例，年龄1～5 个月，平均年龄（3.21±0.68）个月。两组小儿的基础资料分布差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患儿监护人签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-21 mRNA相对表达量

胆道闭锁组患儿在术前1 周内收集外周静脉血标本；正常对照组小儿在体检时留取外周静脉血标本。标本收集后2 h内以3 000 r/min离心10 min，分离上层血清并置于-80℃冰箱冷冻保存备用。采用qRT-PCR 法检测血清中miR-21 mRNA 相对表达量。其引物序列为正向：5'-AGCTTGACCGTAGCGGATG-3'；反向：3'-TCGAAGCTGAAAGCTGAGT-5'。具体步骤：提取总RNA、测定RNA 浓度及纯度、逆转录反应、qRT-PCR 反应。总RNA 提取试剂盒购自加拿大Norgen 公司，逆转录试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，PCR 试剂盒购自北京华夏远洋科技有限公司。以U6为内参，2-△△Ct法计算各组受试小儿miR-21 mRNA 相对表达量。胆道闭锁组患儿根据miR-21 mRNA 相对表达量的中位数进一步分为高miR-21 组和低miR-21 组，每组38 例。

1.3 血清总胆红素检测

取1.2 血液标本，使用德国利霸XL300 全自动生化分析仪检测其血清总胆红素水平。

1.4 肝组织纤维化评分及天冬氨酸转氨酶与血小板比值（APRI）计算

调取病理科胆道闭锁患儿术中肝组织切片，采用改良HAI 的Ishak 系统进行肝纤维化评分[6]。采用0～6 分评分值，随分值增加，肝纤维化程度加重。其中，0 分为无纤维化，1～3 分为低纤维化，4～6 分为高纤维化。同时采用APRI 肝纤维化无创诊断模型对患者肝纤维化程度进行评估[7]，计算APRI，计算公式为APRI=（血清AST/60）×（100/血小板计数）。

1.5 血清肝纤维化指标检测

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清标本中肝纤维化指标的水平，包括层粘连蛋白（LN）、透明质酸酶（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-Col）。酶联免疫试剂盒购自美国Abcam 公司。

1.6 上皮-间质细胞转化（EMT）相关分子相对表达量检测

取胆道闭锁组患儿的术中病变肝脏组织标本，采用qRT-PCR 法检测EMT 相关分子的表达水平，其引物序列分别为E-cadherin正向：5'-AGCTGGTT GACTAGCGTAGT-3'，反向：3'-CTAAGCTGATGGC GTAGTA-5'；ZEB1正向：5'-TAGCTGAGCGGCTGA GAT-3'，反向：3'-ATCGGATGCGGGAACTTAGC-5'。以β-catenin为内参，正向：5’-GCTGGCCCCAGCC GCTGGAG-3’，反向：5’-GAGTGCAGGGTCAGC ACTAC-3’。具体检测步骤同1.2。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验；相关分析用Pearson 法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-21 mRNA相对表达量的比较

胆道闭锁组患儿的miR-21 mRNA相对表达量的中位数为9.33，高miR-21 组、低miR-21 组、正常对照组血清miR-21 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=398.075，P=0.000），高miR-21 组高于低miR-21 组（t=5.818，P=0.000），低miR-21 组高于正常对照组（t=25.095，P=0.000）。见表1。

表1 各组小儿血清miR-21 mRNA相对表达量的比较（±s）

表1 各组小儿血清miR-21 mRNA相对表达量的比较（±s）

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与低miR-21组比较，P<0.05。

microRNA-21 mRNA组别n 11.46±2.13①②8.18±1.14①3.04±0.78高miR-21组低miR-21组正常对照组38 38 50

2.2 血清总胆红素水平的比较

高miR-21 组、低miR-21 组、正常对照组血清总胆红素水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=516.478，P=0.000），高miR-21 组高于低miR-21 组（t=7.754，P=0.000），低miR-21 组高于正常对照组（t=28.913，P=0.000）。见表2。

表2 各组小儿血清总胆红素水平的比较 （mg/dl，±s）

表2 各组小儿血清总胆红素水平的比较 （mg/dl，±s）

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与低miR-21组比较，P<0.05。

血清总胆红素组别n 21.31±3.76①②15.48±2.71①4.10±0.57高miR-21组低miR-21组正常对照组38 38 50

2.3 肝组织纤维化评分及APRI值的比较

高miR-21 组与低miR-21 组肝组织纤维化评分、APRI 比较，差异有统计学意义（P<0.05），高miR-21 组的肝组织纤维化评分、APRI 高于低miR-21 组（P<0.05）。两组纤维化程度比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 不同miR-21表达水平的胆道闭锁患儿肝组织纤维化评分及APRI比较

2.4 血清肝纤维化指标的比较

胆道闭锁患儿中，两组血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），高miR-21 组高于低microRNA-21 组。见表4。

表4 不同microRNA-21表达水平的胆道闭锁患儿血清肝纤维化指标水平比较 （n=38，±s）

表4 不同microRNA-21表达水平的胆道闭锁患儿血清肝纤维化指标水平比较 （n=38，±s）

组别LN/（μg/ml）HA/（mg/L）PCⅢ/（μg/L）Ⅳ-Col/（μg/L）高miR-21组低miR-21组t 值P 值218.39±30.77 142.53±19.86 12.769 0.000 194.37±25.22 128.04±15.19 13.888 0.000 187.51±22.69 141.12±18.63 9.741 0.000 161.07±22.85 99.63±11.74 14.743 0.000

2.5 EMT相关分子相对表达量的比较

胆道闭锁患儿中，两组肝脏组织E-cadherin mRNA 的表达量和ZEB1 mRNA 的表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），高miR-21 组Ecadherin mRNA 的表达量低于低miR-21 组，ZEB1 mRNA 的表达量高于低miR-21 组。见表5。

表5 不同miR-21表达水平的胆道闭锁患儿肝脏组织EMT相关分子mRNA相对表达量的比较 （n=38）

2.6 相关性分析

胆道闭锁患儿血清miR-21 水平与血清总胆红素水平、肝组织纤维化评分、APRI 值呈正相关（r=0.546、0.669 和0.578，P=0.023、0.014 和0.019）；与肝纤维化指标LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col 的水平呈正相关（r=0.781、0.663、0.628 和0.503，P=0.000、0.014、0.018 和0.037）；与E-cadherin mRNA 相对表达量呈负相关（r=-0.614，P=0.018）；与ZEB1 mRNA 相对表达量呈正相关（r=0.607，P=0.019）。

3 讨论

miR-21 是重要的microRNA 之一，除了参与增殖、凋亡、生殖等多个生命过程，越来越多研究发现其在各种病理状态下也发挥重要作用，如CHEN 等[8]研究指出miR-21 参与缺氧/复氧诱导的小鼠肾小管上皮细胞凋亡；SOEDA 等[9]认为miR-21在预测胃癌患者腹膜复发方面意义重大。胆道闭锁约占新生儿长期阻塞性黄疸的50%左右，可导致淤胆性肝硬化，最终发生肝衰竭，是小儿肝移植最常见的适应证。手术是胆道闭锁最有效的治疗方法，但鉴于目前肝源有限的现状，积极延缓胆道闭锁患儿的肝纤维化进程，增加患儿可等待手术的时间对患儿最终治疗结局的改善有重要意义，故需积极明确对胆道闭锁患儿肝纤维化产生重要影响的分子靶点。目前国外研究[10]指出miR-21 可能是胆汁淤积性儿科肝病的重要病因学标志物。胆道闭锁是最严重的胆汁淤积性儿科疾病之一，目前国内关于miR-21 与该病病情的内在联系研究不多。本研究结果发现，胆道闭锁患儿血清中miR-21 mRNA 相对表达量与健康小儿比较有了大幅升高，推测异常高表达的miR-21 可能参与疾病的发生、发展。血清总胆红素水平是反映胆道闭锁患儿病情严重程度的最常用指标，文中胆道闭锁组患儿血清总胆红素水平较正常小儿大幅上升，且其中高miR-21 组上升更为显著，相关性分析进一步证实胆道闭锁患儿血清miR-21 表达量与血清总胆红素水平呈正相关关系，初步说明高miR-21 表达对胆道闭锁病情严重程度有指向性。关于miR-21 在胆道闭锁患儿中表达上调并预示病情较重的具体原因，目前尚未有结论、有待后续基础研究深入明确。

肝纤维化是胆道闭锁患儿胆汁淤积持续加重后对肝脏组织产生损害的最终结果，也是导致患儿治疗预后不佳及死亡的直接原因之一。有研究指出miR-21 可调节肺纤维化[11]、心肌纤维化[12]进程，其是否也通过调节胆道闭锁患儿的肝纤维化进程从而左右整体病情及治疗结局目前尚无结论。研究结果发现，高miR-21 组患儿的肝组织纤维化评分、APRI 均较高，初步说明miR-21 高表达对胆道闭锁患儿肝纤维化的促进作用。检测血清肝纤维化指标水平是佐证纤维化病情严重程度的常用手段，主要包括LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col，既往多用于衡量慢性肝病的炎症活动度及纤维化程度[13-14]。本文中高miR-21 组患儿上述纤维化指标的水平较高，进一步佐证miR-21 在促进胆道闭锁患儿肝纤维化进程方面的作用。

目前大量研究[15-16]提示EMT 可促进产生过多的肌成纤维细胞并使细胞外基质大量堆积，最终导致器官出现纤维化。在胆道闭锁进程中，随胆汁淤积加重肝细胞EMT 进程加速，共同诱导纤维化促进因子TGF-β1的过表达并导致肝纤维化发生发展[17-18]。E-cadherin 是EMT 进程的重要分子，ZEB1可通过抑制E-cadherin 表达而促进EMT 发生发展[19-21]。本研究高miR-21 组患儿肝脏病灶组织ZEB1 mRNA 相对表达量较高，而E-cadherin mRNA相对表达量较低，说明miR-21 高表达预示着旺盛的EMT 过程，推测miR-21 可能通过促进肝细胞EMT 而加速其纤维化过程，从而促进胆道闭锁患儿发生肝纤维化。关于miR-21 对EMT 产生影响的直接机制研究目前涉及极少，有待后续基础研究进一步深入明确。

综上所述，胆道闭锁患儿血清中miR-21 mRNA 相对表达量水平异常升高，且与患儿肝纤维化程度一致，可能通过调节EMT 过程而实现上述作用，但具体机制有待后续细胞研究进一步开展明确。