血清microRNA-618表达与原发性肝癌疗效及预后的关系

韩龄锋，蒋辉，赵俊，徐强，降礼军，蒋鸥

（内江市第二人民医院超声科,四川内江641000）

原发性肝癌（primary hepatic cancer,PHC）是肝胆外科常见的恶性肿瘤，多发于中老年男性群体。目前，该疾病具体发病机制尚未明确，但普遍认为与肝硬化、病毒性肝炎、化学致癌物质等因素关系密切[1]。临床对早期肝癌多采用手术切除治疗，虽然可彻底根除，但部分患者因肝硬化、抵抗力差、肿瘤分期较晚等因素，已无法接受一期手术治疗，故多采用肝动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）、激光、冷冻、高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound,HIFU）等综合治疗方法[2-3]。TACE 是无法手术PHC患者的首选治疗方式，将含有化疗药物的混合剂注入至肝动脉，从而使肿瘤局部保持较高的药物浓度，提高化疗效果，并可通过栓塞切断病灶处血液供应，促使肿瘤细胞凋亡[4-5]。HIFU 是在机体内病变区域聚集穿透性较强的超声波，使该区域瞬时升温，进而促使肿瘤细胞坏死[6]。由于PHC 患者接受TACE 联合HIFU 治疗的术后表现及预后不一，目前临床尚无可靠标志物预测治疗效果及预后。因此，发现可预测术后预后的生物学标志物对PHC 患者的治疗具有重要意义。已有研究证实，microRNA-618（miR-618）是一种肿瘤抑制因子，在胃癌、甲状腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中呈异常表达，可能参与肿瘤发病过程[7]。然而，目前关于miR-618 表达与PHC 的相关研究少有开展，miR-618是否参与PHC 的发生、发展仍需验证。本研究探讨血清miR-618 表达与PHC 疗效及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月—2018年3月在内江市第二人民医院接受治疗的PHC 患者65 例作为病例组。其中，男性42 例，女性23 例；年龄42～75 岁，平均年龄（62.34±4.72）岁；体重指数（BMI）（21.59±2.24）kg/m2。纳入标准：符合《原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015年版）》[8]相关诊断标准，且经临床影像学确诊为PHC 者；Child-Pugh 分级A、B级；患者及家属自愿签署知情同意书；治疗前未接受无水酒精灌注、射频消融等治疗；肿瘤最大直径≤10 cm；肿瘤数量≤3 个。排除标准：合并其他重要器官（心、脑等）恶性肿瘤者；合并凝血功能或其他血液系统疾病者；合并免疫系统疾病者；肿瘤保留不完整、边界模糊者；既往接受过肝胆手术者；已发生远处转移者；门静脉主干癌栓者。另选取同期65 例健康体检者为健康组。其中，男性40 例，女性25 例；年龄43～75 岁，平均（63.06±5.03）岁；平均BMI（22.31±2.46）kg/m2。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 TACE术前常规检查血常规、肝肾功能等，并对患者身体状况进行评估。将患者置于平卧位，局部麻醉，经右侧股动脉穿刺并置管，行腹腔干及肠系膜动脉造影，确定肿瘤的血供情况，并在造影引导下置管至此，缓慢将碘油、化疗药物混合物经压力注射器注入靶血管，在造影的配合下，确保栓塞满意，必要时可多次栓塞。化疗药物：顺铂（广东岭南制药有限公司，国药准字H20183341）50 mg，博来霉素（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20051232）20 mg、吡柔比星（深圳万乐药业有限公司，国药准字H10930105）30 mg、碘化醇50 ml、超液化碘化油（上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31021603）15～20 ml。可根据患者身体状况、肿瘤大小调整用量。

1.2.2 HIFUTACE 术后1～2 周进行HIFU 治疗，术前常规准备，包括肠道准备、治疗区皮肤脱脂脱气处理，采用持续硬膜外麻醉。机载超声明确肿瘤确切位置，在超声的引导、监测下开始治疗，治疗顺序由点至线，由线至面，最后由面至体，为防止肿瘤细胞清除不彻底，各治疗层面需相互重叠。若患者肿瘤位于肝脏膈顶区域或边缘区域，则行全身麻醉。术中注入600～750 ml 人工胸水，在呼吸机帮助下，充分显露被肺部气体、肋骨遮挡的肿瘤区域。为减少术后组织水肿，治疗区皮肤行间歇性冰敷。

1.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清肿瘤标志物水平于治疗前、治疗1 周后采集病例组患者空腹静脉血3 ml，3 000 r/min 离心5 min，取上清液，置入-20℃冰箱冷冻保存，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP-L3）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、高尔基体蛋白-73（GP73）水平，试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；并分析血清肿瘤标志物与miR-618 表达的相关性。

1.3 荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-618相对表达量

采集研究对象空腹静脉血5 ml，室温下12 500 r/min离心15 min，取上清液于干净离心管中，-80℃冰箱冷冻保存。参考Trizol 试剂盒、总RNA 提取试剂盒（爱必信上海生物科技有限公司）说明书提取血清中总RNA，使用逆转录试剂盒（上海研卉生物科技有限公司）将提取的RNA 逆转录成cDNA。将逆转录反应试剂盒放置冰上，融化试剂，按照说明书在miRNA 样本中加入体积为7.5 μl 逆转录反应混合液，混匀，2 000 r/min 离心5 min，使用逆转录热循环仪，采用7.5 μl 反应体系，反应条件：16℃30 min，42℃ 30 min， 85℃ 5 min。 使用美国Applied Biosystems 公司ABI 7500 PCR 仪进行荧光定量测量，反应总体系为20 μl。qRT-PCR 检测miR-618 mRNA相对表达量，全自动qRT-PCR 仪（美国ABI 科技有限公司）进行扩增，反应条件：95℃预变性20 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，循环40 次，72℃延伸10 min。miR-618 正向引物：5'-GGGGAAACTCTACTTGTCCTT-3'，反向引物：5'-TCGTATCCAGTGCGTGTCGT-3'。U6为内参，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。根据2-ΔΔCt法计算miR-618 mRNA 相对表达量。

1.4 观察指标

①两组研究对象治疗前及治疗1 周后miR-618 mRNA 相对表达量；②病例组患者血清miR-618 mRNA 相对表达量与性别、年龄、肿瘤直径、Childpugh 分级、是否伴有肝硬化及癌栓的关系；③病例组患者血清血清AFP、AFP-L3、GPC3、GP73 水平及其与miR-618 表达的相关性。④治疗后随访，统计miR-618 mRNA 高表达、低表达患者平均疾病进展时间（TTP）和中位生存期（MST）。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；相关分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康组和病例组miR-618 mRNA相对表达量比较

健康组血清miR-618 mRNA 相对表达量为（1.03±0.43），病例组治疗前血清miR-618 mRNA相对表达量为（0.72±0.21），治疗后为（0.83±0.19）。病例组治疗前血清miR-618 mRNA 相对表达量与健康组比较，差异有统计学意义（t=5.223，P=0.000），病例组较健康组低；病例组治疗前后血清miR-618 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（t=3.132，P=0.002），治疗后较治疗前高。

2.2 病例组不同临床病理特征患者治疗前血清miR-618 mRNA 相对表达量的比较

病例组不同性别、年龄、肿瘤直径、Childpugh 分级、是否伴有肝硬化及是否癌栓患者治疗前血清miR-618 mRNA 相对表达量比较，经t检验，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 病例组不同临床病理特征患者治疗前血清miR-618 mRNA相对表达量的比较 （±s）

表1 病例组不同临床病理特征患者治疗前血清miR-618 mRNA相对表达量的比较 （±s）

临床病理特征性别n miR-618 mRNA t 值P 值男女年龄42 23 0.68±0.32 0.75±0.29 0.871 0.387<60岁≥60岁肿瘤直径<5 cm≥5 cm Child-pugh分级A级（5～6分）B级（7～9分）肝硬化26 39 0.74±0.33 0.71±0.28 0.394 0.695 30 35 0.77±0.39 0.69±0.25 0.998 0.322 51 14 0.72±0.26 0.71±0.34 0.119 0.906有无癌50 15 0.75±0.41 0.71±0.36 0.340 0.735栓有无6 0.717 0.476 59 0.68±0.36 0.76±0.25

2.3 血清miR-618 mRNA相对表达量与肿瘤标志物水平的关系

病例组治疗前血清miR-618 mRNA 相对表达量为（0.72±0.21），以0.72 作为标准，将病例组分为低表达组（26 例）和高表达组（39 例）。两组治疗后miR-618 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），低表达组比高表达组低。两组治疗后AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），低表达组比高表达组高（见表2）。Pearson 相关分析显示，血清miR-618 mRNA相对表达量与血清AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平呈负相关（r=-0.453、-0.568、-0.412 和-0.612，P=0.000、0.000、0.003 和0.000）。

表2 高表达组、低表达组治疗后miR-618 mRNA相对表达量、血清肿瘤标志物水平比较 （±s）

表2 高表达组、低表达组治疗后miR-618 mRNA相对表达量、血清肿瘤标志物水平比较 （±s）

组别n miR-618 mRNA AFP-L3/（μg/ml）AFP/（μg/ml）GPC3/（μg/ml）GP73/（μg/ml）高表达组低表达组t 值P 值39 26 0.89±0.23 0.63±0.34 3.682 0.000 73.62±11.25 113.29±12.03 13.547 0.000 56.69±6.37 86.92±8.02 16.886 0.000 8.03±2.21 13.03±4.19 6.272 0.000 76.32±19.92 110.35±21.09 63.591 0.000

2.4 低表达组和高表达组的TTP和MST比较

低表达组TTP 为（13.97±1.76）个月、MST 为（21.98±3.06）个月，高表达组TTP 为（25.13±2.25）个月、MST 为（34.06±4.19）个月，两组TTP 和MST 比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=10.691 和28.280，P=0.001 和0.000）。见图1、2。

图1 血清miR-618 mRNA相对表达量高表达组和低表达组的TTP生存曲线

图2 血清miR-618高表达组和低表达组的生存曲线

3 讨论

我国PHC 患者多合并严重的肝硬化，肝功能不全，且恶性程度高、早期转移率高，仅有20%左右的患者可接受以手术为主的综合治疗，故HIFU、TACE 等非手术综合疗法已成为大部分患者的主要治疗方式，但难以完全清除体内所有肿瘤，复发率较高，且预后不理想[9-12]。

肿瘤的发生、发展属于一个分子调控失控过程，涉及诸多环节，包括抑癌基因失活、癌基因激活、细胞基质间黏附障碍及细胞信号传导异常等[13-14]。miRNA 广泛存在于真核生物中，通过与目标mRNA 的3'-UTR 区结合，诱导目标mRNA 降解，调节靶基因蛋白和mRNA 表达，进而参与肿瘤细胞生物学过程[15-16]。miR-618 为miRNA 家族成员，已有研究证实miR-618 异常表达可诱发人类诸多恶性肿瘤及扩张性心肌病[17]。SHI 等[18]报道，胃癌组织中miR-618 表达比邻近非癌组织中低，可见miR-618可能在胃癌中起到抑制肿瘤的作用，且可通过负调节TGF-β2转录水平来抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力。ROSSATO[19]等在一项关于miR-618 介导的表观遗传机制研究中报道，系统性硬化症患者浆细胞样树突状细胞中的miR-618 表达比健康对照者低，miR-618 可能是调节系统性硬化症患者免疫系统稳态的重点靶点，且上调miR-618 表达可抑制PHC 的进展。IVANOVIC 等[20]研究发现，miR-618在转移性雄激素非依赖性前列腺癌中呈低表达，且患者预后与miR-618 表达相关，敲低miR-618 表达可诱导上皮细胞向间充质细胞转化，并促进前列腺癌细胞的侵袭及迁移。以上诸多研究证实，miR-618 可发挥一定的抑癌因子作用，但其在肝癌中是否发挥同样作用及具体的机制尚未完全阐明。本研究采用qRT-PCR 检测PHC 患者及健康体检者血清miR-618 mRNA 相对表达量，结果发现，病例组治疗前血清miR-618 mRNA 相对表达量比健康组低，与上述研究结论基本一致，再次证实miR-618 可发挥抑癌作用。病例组治疗后血清miR-618 mRNA相对表达量比治疗前上升，表明HIFU 结合TACE 治疗有助于上调miR-618 表达，进而抑制病情加重。

考虑到PHC 的发病率及病死率可能与患者的年龄、肿瘤直径、性别等临床特征有关，本研究检测不同临床病理特征PHC 患者miR-618 mRNA 相对表达量的差异，结果发现，病例组患者血清miR-618 mRNA 相对表达量在不同性别、年龄、肿瘤直径、Child-pugh 分级、是否伴有肝硬化及是否癌栓方面差异无统计学意义。谷士海等[21]研究发现，miR-618 在非小细胞肺癌组织中的表达与年龄、性别、组织类型无关，但与肿瘤大小有关，与本研究结论略有出入，可能原因与本研究纳入样本量较少、无法拉大差异等因素有关，故后期需扩大样本量做进一步分析。本研究根据miR-618 mRNA相对表达量分为低表达组和高表达组，结果发现低表达组血清miR-618 mRNA 相对表达量比高表达组低，血清AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平比高表达组高，TTP、MST 比高表达组短；Pearson 相关分析显示，血清miR-618 mRNA 相对表达量与血清AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平呈负相关；由此可见血清miR-618 mRNA 相对表达量与PHC 患者血清肿瘤标志物水平相关，且对预测治疗后患者预后有一定的作用，推测miR-618 可作为预测治疗效果及预后的生物学标志物，但具体机制仍需进一步探讨。

综上所述，miR-618 在PHC 中表达下调，其表达与血清肿瘤标志物水平及预后相关，可能成为PHC 治疗及预后评估的新生物学标志物。