MicroRNA-133表达对人胆管癌细胞QBC939迁移和侵袭的影响*

荣翔，刘小方

（青岛大学附属烟台毓璜顶医院肝胆胰脾外科，山东烟台264000）

胆管癌是近年发病率、病死率增长较快的消化系统恶性肿瘤之一，起病初期症状轻容易被忽视，多数患者在疾病进展至中晚期时才会出现黄疸、尿色深及大便颜色变浅等明显的临床症状，但此时往往已失去手术根治的机会，预后不佳。分子靶向治疗特异性强、副作用少，是近来肿瘤治疗研究的热点，但目前胆管癌的分子靶向治疗技术并不成熟，需要更深入地研究探寻胆管癌发生及进展的分子机制。

作为RNA 家族中的一员，microRNA（miRNA）只含有约22 个核苷酸，却广泛参与各项生命活动，其中的microRNA-133（miR-133）更是被证实在胃癌、肺腺癌中异常表达，并影响肿瘤的发生、发展及恶性程度[1-2]。笔者通过miRCancer 数据库筛选发现，miR-133 可能与胆管癌的进展有关，使用miRBase 数据库进一步筛选发现，肌动蛋白骨架蛋白（LIM and SH3 protein 1,LASP-1）或许是miR-133的下游靶蛋白，包含LIM 及SH3-1 2 个成员，其作用非常广泛，包括和肌动蛋白丝结合来调节细胞的骨架结构、控制信号的转导、影响细胞的运动[3]，以及促进肿瘤细胞的恶性进展等[4-5]。已有研究证实LASP-1 蛋白参与胆管癌细胞迁移及侵袭的调控[6]，但miR-133 是否在胆管癌细胞中异常表达并影响胆管癌细胞的恶性行为，以及miR-133 能否调控LASP-1 蛋白的表达鲜有报道。

本实验通过抑制人胆管癌细胞QBC939 中miR-133 的表达，观察胆管癌细胞LASP-1 蛋白的表达及胆管癌细胞迁移、侵袭行为的变化，分析miR-133 与LASP-1 蛋白的关系及miR-133 对胆管癌细胞迁移、侵袭的影响，验证miR-133 能否调控胆管癌细胞的迁移及侵袭，并探寻其中可能存在的机制，为以miR-133 为靶点的抗胆管癌侵袭和转移治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人胆管癌细胞QBC939（上海吉凯基因公司），胎牛血清、高糖DMEM 培养液（美国Corning 公司），M-MLV 试剂盒（美国Promega 公司），PCR 引物（武汉擎科创新生物科技有限公司），LipofectamineTM2000转染试剂盒（美国赛默飞世尔公司），基质胶Matrigel（美国BD 公司），Trizol 试剂盒（上海普飞生物科技有限公司），miR-133 抑制物、miRNA 模拟物（广州锐博生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

转移电泳槽（JY-ZY5，北京君意东方电泳设备有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（qRTPCR）仪（美国ABI 公司），半干转印系统转印槽1703940（美国伯乐公司），暗室红灯、X 射线胶片（美国柯达公司），化学发光检测系统（美国Pierce生物技术公司），TS-1 水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），PVDF 膜（美国密理博Millipore 公司），5600F 扫描仪（日本佳能公司），Transwell 实验小室（美国Costar 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养将人胆管癌细胞QBC939 接种于DMEM 高糖培养基，于37℃、饱和湿度、二氧化碳体积分数5%条件下培养（后续的细胞培养均在该条件下）。收集对数生长期细胞继续实验。

1.3.2 qRT-PCR检测miR-133a-5p、miR-133a-3p、miR-133b mRNA相对表达量使用Primer 5.0 设计引物（见表1）。提取RNA：将1 ml 的Trizol Reagent与100 mg 培养细胞混合研磨离心，取上清液、250 μl 三氯甲烷及80%的异丙醇混合，12 000 r/min 离心10 min，得到白色沉淀为目标RNA。75%乙醇洗涤，弃液体，溶解后用超微量分光光度计检测吸光度值，调整浓度为200 ng/μl。逆转录得cDNA：加入miRNA 逆转录引物，加入4 μl 5×RT buffer，2 μl 10 mmol dNTPs，1 μl RNase inhibitor（40 u/μl）和1μl M-MLV-RTase（200 u/μl），冰浴。PCR 仪80℃灭活逆转录酶，得到cDNA。qRT-PCR 扩增：2×qPCR Mix，基因引物，cDNA 逆转录产物，ddH2O 组成反应体系，加入实时定量反应光学孔板（96 孔板），qRT-PCR 扩增，反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，循环40 次。检测miR-133 3 种亚型（miR-133a-5p、miR-133a-3p、miR-133b）的表达，U6为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。样本重复检测3 次，选择表达最高的亚型继续实验。

表1 引物序列

1.3.3 实验分组及转染DMEM 培养基中的细胞传代培养，选择细胞融合度达到80%的QBC939 细胞接种于24 孔细胞培养板，按LipofectamineTM2000 说明书操作，将QBC939 细胞转染并分组。①干扰组：每孔加入100 nmol 的miR-133a-5p 抑制物（antimiR-133a-5p）；②阴性对照组：每孔加入50 nmol的miR-133a-5p 模拟物；③空白对照组：自然生长。于前文所述的条件下继续培养24 h。各处理因素的使用剂量均以转染物说明书为依据。

1.3.4 qRT-PCR检测3组细胞miR-133a-5p mRNA相对表达量收集3 组细胞，qRT-PCR 仪检测3 组细胞miR-133a-5p mRNA 相对表达量，U6为内参基因。检测结果采用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量，实验重复3 次。

1.3.5 Transwell 细胞迁移实验使用无血清的DMEM 培养基（内含FBS），加入被胰酶处理过的分组细胞，制成细胞重悬液。Transwell 小室的上室及下室内分别加入细胞重悬液200 μl 和DMEM 高糖培养液600 μl，每组设置3 个复孔。培养72 h，小室使用PBS 缓冲液清洗，95%酒精固定，0.1%结晶紫染色，冲水，晾干。20 倍光镜下，统计5 个随机视野内各组的细胞迁移数量。实验重复3 次。

1.3.6 Transwell 细胞侵袭实验接种前预处理小室：取混合稀释胶（DMEM 培养基与Matrigel 胶按9∶1 的比例混合），加入4℃预冷后Transwell 小室底部膜的上室面。小室的上室及下室内分别加入细胞重悬液200 μl，DMEM 高糖培养液（含30%FBS）600 μl，每组设置3 个复孔。培养72 h，小室使用PBS 缓冲液清洗后去胶，95%酒精固定，0.1%结晶紫染色，冲水，晾干。20 倍光镜下，统计5 个随机视野内各组的细胞侵袭数量。实验重复3 次。

1.3.7 Western blotting 检测LIM 及SH3-1 蛋白的相对表达量细胞冰浴裂解30 min。LIM 及SH3-1 蛋白经SDS-PAGE 电泳移至PVDF 膜。丽春红染色，PBS冲洗。一抗（1∶500）及HRP 酶标二抗（1∶1 000）在室温下孵育1 h。混合发光底物5 min 后，将PVDF膜覆于保鲜膜下，暗箱中显影曝光。Image J 软件分析灰度值，GADPH 为内参。实验重复3 次。

1.4 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism6.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较用Tukey 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-133 3种亚型mRNA相对表达量的比较

miR-133a-5p mRNA 相对表达量为（1.07±0.06），miR-133a-3p mRNA 相对表达量为（0.97±0.11），miR-133b mRNA 相对表达量为（0.73±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（F=9.622，P=0.013）；miR-133a-5p mRNA 相对表达量最高，见图1。选择miR-133a-5p继续实验。

图1 miR-133 3种亚型mRNA相对表达量比较

2.2 3组miR-133a-5p mRNA相对表达量的比较

3 组miR-133a-5p mRNA 相对表达量分别为：干扰组（0.70±0.08）、阴性对照组（1.43±0.34）、空白对照组（0.90±0.17），经方差分析，差异有统计学意义（F=8.459，P=0.018）；干扰组miR-133a-5p mRNA 相对表达量最低。见图2。

图2 3组miR-133a-5p mRNA相对表达量比较

2.3 不同处理因素对人胆管癌细胞QBC939 迁移、侵袭的影响

2.3.13 组细胞迁移数量的比较3 组细胞迁移数量分别为：干扰组（72.0±11.0）个，阴性对照组（110.3±4.2）个，空白对照组（106.0±10.4）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=16.040，P=0.004）；干扰组人胆管癌细胞QBC939 的迁移数量最少。见图3。

图3 3组Transwell迁移实验结晶紫染色图（×20）

2.3.2 3组细胞侵袭数量的比较3 组细胞侵袭数量分别为：干扰组（20.0±3.0）个，阴性对照组（65.0±2.6）个，空白对照组（83.7±3.5）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=340.200，P=0.000）；干扰组人胆管癌细胞QBC939 的侵袭数量最少。见图4。

图4 3组Transwell侵袭实验结晶紫染色图（×20）

2.4 不同处理因素对人胆管癌细胞QBC939 LIM 及SH3-1 蛋白表达的影响

2.4.13 组LIM 蛋白相对表达量的比较3 组LIM蛋白相对表达量分别为：干扰组（0.85±0.02），阴性对照组（0.30±0.06），空白对照组（0.28±0.05），经方差分析，差异有统计学意义（F=137.000，P=0.000）；干扰组人胆管癌细胞QBC939 LIM 蛋白相对表达量最多。见图5、6。

图5 3组胆管癌细胞中LIM、SH3-1蛋白的表达

图6 3组LIM蛋白的相对表达量比较

2.4.23 组SH3-1 蛋白相对表达量的比较3 组SH3-1 蛋白相对表达量分别为：干扰组（0.71±0.01），阴性对照组（0.98±0.03），空白对照组（0.99±0.01），经方差分析，差异有统计学意义（F=263.200，P=0.000）；干扰组人胆管癌细胞QBC939 SH3-1 蛋白相对表达量最少。见图5、7。

图7 3组SH3-1蛋白的相对表达量比较

3 讨论

伴随着老年人口在社会总人口中的占比提升，癌症的发病率也越来越高。胆管癌作为一种恶性程度较高的消化系统肿瘤，其早期诊断和有效治疗方案一直是临床工作中的难题。因此，需要更深入地了解胆管癌的发病机制，从根本上改变胆管癌患者的预后。

miRNA 能作用于mRNA，通过抑制翻译和促进降解，降低DNA 转录后的表达水平[7]。这一作用存在于多种肿瘤细胞中，例如在非小细胞肺癌中，miR-7-5p 可以靶向调控下游p53基因，使其对应的mRNA 翻译更加活跃，从而抑制非小细胞肺癌的增殖和侵袭[8]。一些miRNA 能反映癌症的进展及患者的预后，如miR-363、miR-127-3p、miR-224 分别在肝癌、食管鳞癌及胆管癌细胞中表达失衡，且失衡的程度与疾病的进展呈正相关，对患者的生存评估具有一定的指导意义[9-11]。目前的研究发现，miR-133 在多种癌症进展中发挥抑癌基因的作用，如miR-133 可直接靶向负调控YES1原癌基因的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖和集落形成[12]。miR-133在胃癌、肺癌及结直肠癌中也表现出同样的能力，其表达水平与癌症进展呈负相关[13-15]。而笔者使用miRCancer 信息库筛选后，发现miR-133 与胆管癌的进展也可能存在关联，因此选择miR-133 作为本实验的研究对象。首先通过qRT-PCR 检测发现，miR-133 的3 种亚型在人胆管癌细胞QBC939 中的表达的确存在差异，miR-133a-5p 的表达最高，故选择miR-133a-5p 进行后续的干扰实验。通过细胞转染分组培养，qRT-PCR 检测发现干扰组人胆管癌细胞QBC939 的miR-133a-5p 表达明显下降，说明转染miR-133a-5p 抑制剂有效减少人胆管癌细胞QBC939 miR-133a-5p 的表达。在Transwell 实验中，笔者观察到干扰组胆管癌细胞的迁移、侵袭数量均低于空白对照组及阴性对照组，提示miR-133a-5p的低表达可使人胆管癌细胞的迁移、侵袭能力降低，推断miR-133a-5p 在胆管癌细胞中很有可能发挥类似癌基因的作用，使胆管癌的恶性程度加重。

通过miRBase 信息库的筛选，笔者发现LASP-1可能是miR-133a-5p 的下游靶蛋白，miR-133a-5p很有可能调控LASP-1 蛋白的表达。LASP-1基因位于人7 号染色体长臂17 区到21 区[16]，其表达产物LASP-1 蛋白有LIM 及SH3-1 2 个家族成员，在维持细胞形态及调节细胞运动过程中发挥着重要的作用。LASP-1 蛋白可以通过诱导细胞分裂周期的停滞，影响细胞的增殖、分化能力[17]。LASP-1 蛋白的过表达能显著强化肿瘤细胞的攻击性，如在结直肠癌细胞中，LASP-1 蛋白可通过上调基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，在延缓肿瘤细胞凋亡的同时加速肿瘤细胞的增殖与转移[18]。本研究结果发现，干扰组人胆管癌细胞的LASP-1 蛋白表达发生变化：与阴性对照组和空白对照组比较，干扰组人胆管癌细胞的SH3-1 蛋白相对表达量降低，LIM蛋白相对表达量增加，提示miR-133a-5p 可调控LASP-1 蛋白的表达，敲减miR-133a-5p 能使人胆管癌细胞的SH3-1 蛋白表达下调、LIM 蛋白表达上调。ZHANG 等[6]证实LASP-1 蛋白具有调控胆管癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力，其机制与破坏Bcl-2蛋白家族平衡[19]及加速上皮-间质转化（EMT）[20]有关。而LASP-1 蛋白家族中的SH3-1 蛋白有加速细胞运动及侵袭的能力[21]，当SH3-1 蛋白表达减少时，细胞的运动及侵袭将会受到抑制，这与本研究结果中干扰组人胆管癌细胞的低SH3-1 表达及迁移、侵袭减弱一致。因此，笔者推测miR-133a-5p对人胆管癌细胞迁移、侵袭的影响可能是通过miR-133a-5p 对LASP-1 蛋白表达的调控实现的。但目前尚不明确这一过程的具体信号通路，需要未来实验更深入的研究。

综上所述，miR-133a-5p 可调控人胆管癌细胞QBC939 LASP-1 蛋白的表达，敲减miR-133a-5p 能使胆管癌细胞的SH3-1 蛋白表达下调、LIM 蛋白表达上调；miR-133a-5p 的低表达能抑制人胆管癌细胞QBC939 的迁移和侵袭，这可能与miR-133a-5p调控LASP-1 蛋白的表达有关。miR-133a-5p 可能通过调控LASP-1 蛋白的表达进而影响人胆管癌细胞的恶性行为，这为以miR-133a-5p 为新型分子靶点的抗胆管癌迁移、侵袭治疗提供了广阔的前景，也为胆管癌的早期诊断提供了新的思路。