幽门螺杆菌通过Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞侵袭及血管新生因子的作用研究*

赵越，冯菲，王军，勾熙，舒小闯，蒲柯，彭宇奎，王玉平

（兰州大学第一医院1.消化科，2.超声医学科，甘肃兰州730020）

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，发病率不断升高，发病人群呈年轻化趋势[1]。胃癌的发生涉及多因素、多环节、多基因，但具体机制并未完全阐明。幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）感染是引起胃癌的危险因素之一。Hp 感染后能够引起宿主细胞中癌基因的表达，信号通路激活发生改变，进而引起细胞异常增殖、迁移、侵袭及血管新生[2-4]。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路是与胃癌发生、发展密切相关的信号通路，上游信号分子Wnt3 及下游信号分子β-catenin 的表达在胃癌组织中升高，表达升高的β-catenin 进入细胞核后能够调节多种侵袭基因表达，生成血管新生分子，进而促进胃癌细胞的侵袭、血管新生。有研究报道，Hp 感染能够促进胃黏膜上皮GES-1 细胞中Wnt/β-catenin 信号通路的激活[5]。但Hp 感染是否直接促进胃癌细胞中Wnt/βcatenin 信号通路的激活以及是否通过Wnt/β-catenin信号通路调节胃癌细胞侵袭、血管新生均未阐明。为此，本实验将以胃癌细胞株SGC-7901 为对象，具体分析Hp通过Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞侵袭及血管新生能力的调节作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床样本及分组收集2015年5月—2018年12月在兰州大学第一医院手术切除的胃癌蜡块样本84例，根据Hp感染情况分为Hp阴性胃癌组织45 例及Hp阳性胃癌组织39 例。

1.1.2 细胞胃癌细胞株SGC-7901 购自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.3 HpHp 标准菌株购自北京NTCC 中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

1.1.4 试剂石蜡包埋组织切片总RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链合成预混试剂盒、Talent 荧光定量检测试剂盒购自北京天根公司，Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂ICG-001、结晶紫购自美国Sigma 公司，RIPA 裂解液购自上海碧云天公司，兔来源Wnt1、Wnt3a、β-catenin、基质金属蛋白酶7（MMP-7）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、E-钙黏蛋白（Ecadherin）的单克隆一抗购自美国Abcam 公司，血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管生成素-2（Ang-2）的酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海西唐公司。

1.1.5 仪器细胞培养箱购自美国Thermo 公司，显微镜购自日本Nikon 公司，凝胶成像仪购自美国Bio-rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌组织中目的基因mRNA相对表达量的检测取胃癌蜡块标本，采用石蜡包埋组织切片总RNA 提取试剂盒分离RNA，采用cDNA 第一链合成预混试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，采用Talent 荧光定量检测试剂盒对cDNA 中的目的基因Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、E-cadherin、VEGF、bFGF、Ang-2及内参基因β-actin进行PCR 反应，得到反应曲线及循环阈值，以β-actin为内参计算目的基因mRNA 的相对表达量。

1.2.2 Hp培养基菌体提取物制备将Hp菌株接种在含有10%胎牛血清的布氏肉汤培养基中，在微需氧、37℃环境下培养48 h，离心收集细菌后用磷酸盐缓冲溶液重悬，4℃保存备用。

1.2.3 细胞培养、分组及处理SGC-7901 细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培养，细胞铺满底面80%后用0.25%胰蛋白酶消化并传代，传代细胞接种在培养板中并分组处理。对照组用不含细菌及药物的DMEM 处理，连续处理24 h；Hp组加入感染复数100∶1的Hp 菌液进行处理，连续处理24 h；Hp+ICG-001 组预先用含有4 μmol/L ICG-001 的DMEM 处理12 h，而后再加入感染复数100∶1 的Hp 菌液并继续处理24 h。

1.2.4 Western blotting 检测采用RIPA 裂解液裂解分组处理后的细胞，提取蛋白后进行Western blotting 检测。测定蛋白含量后取30 μg 蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶中，电泳后电转移至NC 膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后4℃孵育Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、E-cadherin 的单克隆一抗过夜；第2 天室温孵育HRP 二抗1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，根据条带的灰度值计算蛋白相对表达量。

1.2.5 Transwell 检测细胞侵袭活力在预涂基质胶的Transwell 小室中检测细胞侵袭活力，在上层小室内接种细胞并按分组方法进行处理，在下层小室内加入含有10%胎牛血清的DMEM 诱导细胞侵袭。分组处理24 h 后，取出小室，用棉签擦未侵袭的细胞，结晶紫染色后在显微镜的高倍视野下观察侵袭细胞数目。

1.2.6 血管新生分子含量的检测采用酶联免疫吸附试验检测分组处理后细胞培养基中血管新生分子VEGF、bFGF、Ang-2 的含量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp 阴性和Hp 阳性胃癌组织中目的基因相对表达量的比较

与Hp 阴性胃癌组织比较，Hp 阳性胃癌组织中Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、VEGF、bFGF、Ang-2 的mRNA相对表达量均升高（P<0.05），E-cadherin mRNA 的相对表达量降低（P<0.05）。见表1。

表1 Hp阴性和阳性胃癌组织中目的基因mRNA相对表达量的比较 （±s）

表1 Hp阴性和阳性胃癌组织中目的基因mRNA相对表达量的比较 （±s）

组别Wnt1 mRNA Wnt3a mRNA β-catenin mRNA MMP-7 mRNA N-cadherin mRNA E-cadherin mRNA VEGF mRNA bFGF mRNA Ang-2 mRNA Hp阴性胃癌组织Hp阳性胃癌组织t 值P 值0.73±0.15 1.32±0.24 13.697 0.000 0.69±0.12 1.29±0.34 11.077 0.000 0.81±0.19 1.24±0.28 8.134 0.000 0.75±0.13 1.38±0.31 12.438 0.000 0.66±0.19 1.40±0.35 12.258 0.000 1.31±0.41 0.79±0.24 7.206 0.000 0.59±0.09 1.49±0.52 11.424 0.000 0.65±0.08 1.43±0.34 14.932 0.000 0.82±0.18 1.27±0.33 7.896 0.000

2.2 Hp 对SGC-7901 细胞中Wnt/β-catenin 信号通路的影响

3 组SGC-7901 细胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 蛋白相对表达量的比较，差异有统计学意义（F=7.615、9.283 和7.953，均P=0.000）。进一步两两比较t检验，Hp组SGC-7901细胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量较对照组明显增加（P<0.05）；Hp+ICG-001组SGC-7901 细胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 蛋白相对表达量较Hp组明显减少（P<0.05）。见表2和图1。

图1 3组Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量的比较

表2 3组细胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin相对表达量的比较 （±s）

表2 3组细胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与Hp组比较，P<0.05。

组别β-catenin蛋白Wnt1蛋白Wnt3a蛋白对照组Hp组Hp+ICG-001组F 值P 值1.19±0.32 1.84±0.52①1.33±0.36②7.953 0.000 1.20±0.27 1.82±0.34①1.24±0.32②7.615 0.000 1.23±0.35 2.03±0.52①1.44±0.41②9.283 0.000

2.3 Hp 通过Wnt/β-catenin 信号通路增强SGC-7901细胞的侵袭活力

对照组SGC-7901 细胞侵袭数目为（24.10±6.59），Hp 组为（71.93±11.58），Hp+ICG-001 组为（34.12±9.39），3 组比较经方差分析，差异有统计学意义（F=13.474，P=0.000）。进一步两两比较t检验，Hp组SGC-7901 细胞的侵袭数目较对照组明显增加（P<0.05）；Hp+ICG-001 组SGC-7901 细胞的侵袭数目较Hp组明显减少（P<0.05）。见图2。

图2 3组细胞的结晶紫染色结果（A）及侵袭活力比较(B)

2.4 Hp 通过Wnt/β-catenin 信号通路增加SGC-7901细胞中MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相对表达量

3 组SGC-7901 细胞中MMP-7、N-cadherin、Ecadherin蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（F=16.585、16.585 和14.557，均P=0.000）。经LSD-t法两两比较，Hp 组SGC-7901 细胞中MMP7、N-cadherin 蛋白相对表达量较对照组增加（P<0.05），E-cadherin 蛋白相对表达量较对照组减少（P<0.05）；Hp+ICG-001组SGC-7901 细胞中MMP-7、N-cadherin 蛋白相对表达量较Hp组减少（P<0.05），E-cadherin蛋白相对表达量较Hp组增加（P<0.05）。见表3和图3。

图3 3组细胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相对表达量的比较

表3 3组细胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相对表达量的比较 （±s）

表3 3组细胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与Hp组比较，P<0.05。

组别E-cadherin蛋白MMP-7蛋白N-cadherin蛋白对照组Hp组Hp+ICG-001组F 值P 值1.21±0.32 0.36±0.09①1.02±0.20②14.557 0.000 0.23±0.08 0.83±0.19①0.45±0.09②16.585 0.000 0.32±0.07 0.91±0.21①0.28±0.06②13.018 0.000

2.5 Hp 通过Wnt/β-catenin 信号通路增加SGC-7901细胞中血管新生因子的生成

3 组SGC-7901 细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2 含量的比较，差异有统计学意义（F=13.737、9.283 和11.384，均P=0.000）。进一步两两比较t检验，Hp 组SGC-7901 细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量较对照组增加（P<0.05）；Hp+ICG-001组SGC-7901细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量较Hp组减少（P<0.05）。见表4和图4。

图4 3组细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比较

表4 3组细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比较 （±s）

表4 3组细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与Hp组比较，P<0.05。

组别Ang-2/（ng/ml）VEGF/（ng/ml）bFGF/（pg/ml）对照组Hp组Hp+ICG-001组F 值P 值1.01±0.23 2.65±0.62①1.72±0.36②11.384 0.000 1.33±0.29 4.23±0.92①1.94±0.45②13.737 0.000 16.69±3.25 42.39±8.79①27.67±7.14②9.283 0.000

3 讨论

Wnt/β-catenin 信号通路是与多种恶性肿瘤发生、发展密切相关的信号通路，Wnt1、Wnt3a 是该信号通路经典的上游信号分子，高表达的Wnt1、Wnt3a 与膜受体Lrp5/6 结合后使细胞内的GSK-3β发生磷酸化，磷酸化的GSK-3β 失去水解β-catenin的活性，进而引起细胞内β-catenin 增多并不断向核内转移，进入细胞核的β-catenin 能够调节多种癌基因的表达并引起细胞的恶变[6-8]。胃癌与Wnt/β-catenin 信号通路的关系也被多项研究证实[9-10]，但胃癌组织中该通路发生激活的机制尚未完全明确。

Hp 感染是目前已知与胃癌发生密切相关的危险因素，Hp 感染胃黏膜上皮细胞后，细胞中多种基因的表达发生改变，进而可造成相应细胞学行为的变化[4,11]。吴莺等[5]以人胃黏膜上皮细胞GES-1为对象的细胞实验证实，Hp 感染GES-1 细胞后，细胞中β-catenin 的表达明显增多，提示Hp 感染与Wnt/β-catenin 信号通路的激活有关。本实验首先分析胃癌组织中Hp 感染与Wnt/β-catenin 信号通路激活的关系， 结果发现Hp 阳性胃癌组织中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 的mRNA 相对表达量明显高于Hp 阴性胃癌组织。在该基础上，本实验以胃癌SGC-7901 细胞为对象，用Hp感染后观察Wnt/βcatenin 信号通路的变化。本实验的观察结果显示：Hp 感染后细胞中Wnt1、Wnt3a 及β-catenin 蛋白相对表达量均明显增加，说明Hp 感染能够激活胃癌细胞中Wnt/β-catenin 信号通路，激活Wnt/β-catenin信号通路也可能是Hp 感染参与胃癌发生、发展的机制。

为进一步验证Hp 感染是否通过激活Wnt/βcatenin 信号通路参与胃癌的发生、发展，本实验在Hp 感染的基础上加用Wnt/β-catenin 信号通路的抑制剂ICG-001 并观察细胞侵袭、血管新生能力的变化。Hp 感染后，细胞侵袭数目明显增多；而在加用ICG-001 后，Hp 感染增加细胞侵袭数目的效应明显减弱，说明Hp 感染通过激活Wnt/β-catenin 信号通路促进胃癌细胞的侵袭。已有研究报道，Wnt/β-catenin 信号通路激活后能够增加下游MMP-7、N-cadherin 的表达，同时抑制E-cadherin 的表达，促进细胞外基质的水解及细胞上皮间质的转化，进而增强细胞的侵袭能力[13-14]。本实验通过检测上述蛋白表达的变化来进一步验证Hp 感染调控胃癌细胞侵袭的作用及机制可知：Hp 感染后，细胞中MMP-7、N-cadherin 蛋白相对表达量增加，Ecadherin 的相对表达量减少；而在加用ICG-001 后，Hp 感染调节上述蛋白表达的作用减弱，这一结果与细胞侵袭数目的变化结果一致，进一步验证了Hp 感染通过激活Wnt/β-catenin 信号通路促进胃癌细胞侵袭的作用。

肿瘤血管新生是胃癌局部病灶内重要的恶性生物学行为之一，同时也是癌细胞增殖、侵袭的重要病理基础。Wnt/β-catenin 信号通路所调控的VEGF、bFGF、Ang-2 与血管新生密切相关，能够刺激内皮细胞的增殖和血管样结构的形成。已有研究报道，胃癌患者血清中VEGF、bFGF、Ang-2的含量均明显增多[14-16]。本实验对血管新生因子的观察发现：Hp 感染后，细胞培养基中VEGF、bFGF、Ang-2 的含量增加；而在加用ICG-001 后，Hp 感染增强VEGF、bFGF、Ang-2 生成的作用减弱，Hp感染通过激活Wnt/β-catenin 信号通路促进胃癌细胞中血管新生因子的生成、增强细胞的血管新生能力。

综上所述，Hp 能够激活胃癌细胞中Wnt/βcatenin 信号通路并增强细胞的侵袭能力、血管新生能力。激活Wnt/β-catenin 信号通路是Hp 感染增强胃癌细胞侵袭及血管新生能力的分子机制之一。