银兰含漱方UPLC指纹图谱及6种成分含量测定研究

江洁怡，曾志浩，黄华靖，李素梅，胥爱丽，李养学

（1.广东省中医药工程技术研究院，广东广州 510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095；3.广州中医药大学第五临床医学院，广东广州 510405）

银兰含漱方是广东省第二中医院临床应用多年的经验方，是治疗脾胃湿热或湿浊内阻的口腔溃疡、口臭等口腔疾病的协定处方，由金银花、黄芩、薄荷、甘草、佩兰、丁香组成，其中金银花主要含有黄酮类、环烯醚萜苷类等成分[1]，黄芩中主要含有黄酮及黄酮苷类化合物[2]，二药共为君药，共奏清热燥湿、泻火解毒功效；佩兰主要含挥发油、黄酮类成分[3‑4]，芳香化湿，为臣药；薄荷主要含有挥发油、黄酮类等成分[5]，丁香主要含挥发油、色酮苷等[6‑7]，两者共为佐药；甘草主要有三萜皂苷类、甘草多糖类等化学成分[8‑9]，为使药；以上诸药合用，共奏清热化浊、芳香辟秽之功。

银兰含漱方在广东省第二中医院临床口腔护理中应用多年，能有效地治疗口腔溃疡、去除异味、防治口腔炎症，复发率低，具有良好的应用前景，但质量标准研究方面仍不深入，仅建立了其检查项、薄层鉴别、单成分含量测定方法，阻碍了其进一步的推广利用，提高及完善其质量控制体系成了亟待解决的问题。众所周知，化学成分是药效物质发挥作用的基础，中药特别是复方制剂，化学成分复杂，且具有多靶点、协同作用的特点，单一指标成分难以全面评价其内在质量，而指纹图谱技术能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，指纹图谱结合模式识别方法能有效弥补现有质量控制方法的不足[10‑11]。本研究对15批银兰含漱方进行指纹图谱研究，测定其中甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素6个成分的质量浓度，并应用指纹图谱相似度评价结合PCA分析和PLS‑DA分析对其结果进行分析，为银兰含漱方的质量控制提供科学依据，为其开发成为安全有效、稳定可控的中药新药奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1290色谱仪（美国Agilent公司）；XS205DU电子分析天平（瑞士梅特勒‑托利多公司）；Milli‑QAdvantage型A10自动型纯水机（美国Millipore公司）。

绿原酸（批号：110753‑201415，质量分数96.1%）、甘草苷（批号：111610‑201106，质量分数93.7%）、黄芩苷（批号：110715‑201821，质量分数95.4%）、汉黄芩苷（批号：112002‑201702，质量分数98.5%）、黄芩素（批号：111595‑201607，质量分数98.5%）、甘草酸铵（批号：110731‑201116，质量分数93.1%）均购自中国食品药品检定研究院；隐绿原酸（批号：Y‑067‑180425，质量分数98%）、新绿原酸（批号：RFS‑X01411804010，质量分数99.83%）、汉黄芩素（批号：H‑029‑160802，质量分数98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲酸、磷酸、乙腈等液相用试剂为色谱纯（德国Merck公司）；甲醇等其余试剂均为分析纯（广州化学试剂厂）；水为蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

银兰含漱方（批号：20180201、20180202、20180203、20180501、20180502、20180503、20180801、20180802、20180803、20190101、20190102、20190103、20190401、20190402、20190403，依次编号为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15）由广东省第二中医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密量取银兰含漱方约1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2 阴性样品溶液的制备

按照银兰含漱方的处方和制备工艺，分别制备缺金银花、黄芩、薄荷、甘草、佩兰、丁香的阴性样品，再按“2.1”项方法制备6种阴性样品溶液。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，分别加甲醇制成含隐绿原酸（245.00μg/mL）、新绿原酸（367.50μg/mL）、绿原酸（225.00μg/mL）、甘草苷（292.22μg/mL）、黄芩苷（741.42μg/mL）、汉黄芩苷（215.52μg/mL）、黄芩素（181.67μg/mL）、甘草酸铵（237.78μg/mL）、汉黄芩素（124.72μg/mL）的溶液，作为对照品储备液。

分别取上述对照品溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成含隐绿原酸24.50μg/mL、新绿原酸36.75μg/mL、绿原酸22.50 μg/mL、甘草苷29.22μg/mL、黄芩苷24.71μg/mL、汉黄芩苷17.96μg/mL、黄芩素18.16μg/mL、甘草酸铵23.78μg/mL、汉黄芩素12.47μg/mL的混合对照品溶液。

2.4 色谱条件

采用Phenomenex Luna Omega PS C1（82.1 mm×150 mm，1.6μm）色谱柱；柱温为30℃；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸（含0.05%磷酸）为流动相B，进行梯度洗脱（0~2 min，5%→11%A；2~7 min，11%A；7~10 min，11%→20%A；10~17 min，20%→28%A；17~19 min，28%→30%A；19~22 min，30%→58%A；22~25 min，58%A）；流速为0.40 mL/min；检测波长为245 nm；进样量为1μL；理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于5 000。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 精密度试验 取同一供试品溶液（批号20190101），按“2.4”项色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图，以汉黄芩苷峰（10号峰）为参照，计算13个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 分别取同一批次样品（批号20190101），按“2.1”项方法制备供试品溶液，平行6份，并按“2.4”项色谱条件进样测定，记录色谱图，以汉黄芩苷峰（10号峰）为参照，计算13个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果RSD值均小于2%，表明方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（20190101），按“2.4”项色谱条件，分别在放置0、2、4、8、12、24 h后进样测试，记录色谱图，以汉黄芩苷峰（10号峰）为参照，计算13个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果RSD值均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 指纹图谱的建立及相似度评价 分别精密吸取不同批次（S1~S15）的银兰含漱方供试品溶液及混合对照品溶液各1μL，注入UPLC色谱仪中，按“2.4”项色谱条件进样测定，将记录得到的各批次色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1 min，自动匹配，生成共有模式图，标定了13个共有峰为特征峰，并通过与对照品保留时间及紫外全波长扫描图比对，指认了其中9个共有峰，分别为1号峰隐绿原酸、3号峰新绿原酸、4号峰绿原酸、6号峰甘草苷、7号峰黄芩苷、10号峰汉黄芩苷、11号峰黄芩素、12号峰甘草酸、13号峰汉黄芩素，见图1、2。15批银兰含漱方供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.964、0.982、0.998、0.960、0.997、0.994、0.973、0.998、0.998、0.996、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999，均 大于0.9，相似度评价表明，15批供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相关性良好，各批次银兰含漱方化学成分一致，主要差异表现在各成分的含量上。

图1 15批银兰含漱方UPLC叠加图谱Figure 1 UPLCoverlay chromatograms of 15 batches of Yin‑lan Hanshufang

图2 银兰含漱方对照指纹图谱Figure 2 Comparison fingerprint of Yinlan Hanshufang

2.5.5 银兰含漱方指纹图谱PCA分析 分别使用SPSS 26.0软件和SIMCA 14.1软件对15批银兰含漱方的指纹图谱共有峰峰面积归一化处理后的数据进行PCA分析。

首先采用SIMCA 14.1软件，对15批银兰含漱方样品进行主成分分析（PCA），选取特征值最大的4个主成分进行拟合分析，其累积方差贡献率94.138%，得到15批银兰含漱方样品的Scores图，见图3。结果显示，所有样品均在95%可信区间内，且15批样品没有明显的聚类趋势，说明15个批次的银兰含漱方质量较一致。

图3 15批银兰含漱方的二维主成分得分图Figure 3 Two dimensional principal component score scatter of 15 batches of Yinlan Hanshufang

表2 银兰含漱方主成分因子载荷矩阵Table 2 Principal component load matrix of Yinlan Hanshu‑fang

采用SPSS 26.0软件，提取特征值大于1的成分，得到主成分特征值和方差贡献率、主成分载荷矩阵（见表1、2）。由结果可知，前4个主成分的方差累计贡献率为94.138%，其代表了15批样品中13个共有峰的94.138%信息量，体现了样品的基本特征和主要信息，其中第1主成分信息主要来自2、3、5~10、13号峰；第2主成分信息主要来自4号峰；第3主成分信息主要来自1、11号峰；第4主成分信息主要来自12号峰，上述成分在特征变量的重要性评估中具有优势。2.5.6 PLS‑DA分析 将15批银兰含漱方按照生产月份分为201802、201805、201808、201901、201904共5类，采用SIMCA 14.1软件，对15批银兰含漱方中13个共有峰峰面积归一化处理后数据进行PLS‑DA分析，得到变量重要性投影（Variable Impor‑tance in Projection,VIP）值图（见图4）。由VIP图可直观得出各色谱峰影响程度，依次为2号峰>6号峰>9号峰>5号峰>7号峰>8号峰>4号峰>10号峰>12号峰>3号峰>13号峰>1号峰>11号峰。13个共有峰中，2号峰、6号峰（甘草苷）、9号峰、5号峰、7号峰（黄芩苷）、8号峰、4号峰（绿原酸）、10号峰（汉黄芩苷）的VIP值大于1，说明变量对模型分类的贡献具有统计学意义，可作为差异标志物。

表1 银兰含漱方PCA特征值与方差贡献率Table 1 PCA eigenvalues and variance contribution rate of Yinlan Hanshufang

图4 15批银兰含漱方PLS‑DA模型中11个共有峰的VIP值图Figure 4 VIPvalues of 11 common peaks in PLS‑DA model of 15 batches of Yinlan Hanshufang

2.6 多指标含量测定

2.6.1 线性关系考察 分别精密吸取不同体积的各对照品储备溶液，加甲醇稀释，制得质量浓度分别含 甘 草 苷29.20、87.60、146.00、204.40、262.80、292.00μg/mL；黄芩苷247.14、741.42、1 235.70、1 729.98、2 224.26、2 471.40μg/mL；汉黄芩苷17.96、35.92、53.88、71.84、89.80、107.76μg/mL；黄芩素18.16、54.48、90.80、127.12、163.44、181.60μg/mL；甘草酸23.78、71.34、118.90、166.46、214.02、237.80 μg/mL；汉黄芩素12.47、37.41、62.35、87.29、112.23、124.70μg/mL的系列对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液1μL，注入UPLC色谱仪，按“2.4”项色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积。以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。结果见表3。

表3 线性关系考察结果Table 3 Results of the linear relationship

2.6.2 专属性试验 分别精密吸取“2.3”项的混合对照品溶液、“2.1”项供试品溶液及“2.2”项各阴性样品溶液1μL，按“2.4”项色谱条件依法进样测定，结果见图5。结果显示，待测成分甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸和汉黄芩素可与相邻成分达到基线分离，阴性样品无干扰。

图5 对照品、供试品与阴性样品的色谱图Figure 5 UPLCchromatograms of mixed reference substanc‑es,test sample and negative sample

2.6.3 精密度试验 取同一供试品溶液（20190101），按“2.4”项色谱条件连续进样测定6次，记录各峰峰面积，计算得RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 重复性试验 分别取一批次样品（20190101），按“2.1”项方法制备供试品溶液，平行6份，并按“2.4”项色谱条件进样测定，记录各峰峰面积，计算得到甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素RSD值分别为1.18%、1.28%、1.16%、0.95%、1.07%、1.22%，RSD均小于2%，表明方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（20190101），按“2.4”项色谱条件，分别在放置0、2、4、8、12、24 h后进样测试，记录各峰峰面积，计算得RSD均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.6 中间精密度试验 分别由2名不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批次样品（20190101），按“2.1”项方法制备供试品溶液，每次平行6份，并按“2.4”项色谱条件进样测定，记录各峰峰面积，计算得到各成分含量及RSD，结果RSD均小于2%，表明分析方法中间精密度良好。

2.6.7 加样回收率试验 取9份已测定含量样品（20190101）0.5 mL，分别精密加入一定量的对照品，分别按“2.1”项方法制备供试品溶液9份，按“2.4”项色谱条件进样分析，计算得到甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的平均加样回收率分别为97.91%、100.85%、97.99%、100.01%、98.91%、98.85%，RSD分别为1.95%、1.23%、1.94%、1.78%、1.92%、1.43%。

2.6.8 样品质量浓度测定 取15批银兰含漱方样品，分别按“2.1”项方法制备供试品溶液，并按“2.4”项色谱条件进样测定，记录峰面积，计算各批次中甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的质量浓度，结果见表4。

从表4可见，15批银兰含漱方中各批次之间的成分质量浓度差异比较大。甘草苷的质量浓度为0.22～0.57μg/mL，平均为0.37μg/mL，其中S1的浓度最低；黄芩苷的质量浓度为0.11～3.25μg/mL，平均为2.10μg/mL，各批次之间的差异比较大，其中S15的最高；汉黄芩苷的质量浓度为0.21～0.68μg/mL，平均为0.44μg/mL；黄芩素的质量浓度为0.05～0.23μg/mL，平均为0.10μg/mL；甘草酸的质量浓度为0.03～0.14μg/mL，平均为0.08μg/mL；汉黄芩素的质量浓度为0.14～0.45μg/mL，平均为0.27μg/mL。

表4 15批银兰含漱方样品质量浓度测定结果Table 4 Results of determination of 15 batches of Yinlan Hanshufang ρ/(mg·mL−1)

3 讨论

研究前期将所制备的供试品溶液在波长210～400 nm进行全波长扫描，结果显示在波长为245 nm处各色谱峰的丰度、数目、分离度较好，故选择该波长为检测波长。为了得到更优的色谱条件，先后考察了不同色谱柱（Waters CORTECSUPLC T3、Phenomenex Luna Omega PS、Agilent Poroshell 120 EC C18）、不同流动相体系（乙腈‑0.1%甲酸水溶液、乙腈‑0.1%甲酸（含0.05%磷酸）水溶液、甲醇‑0.1%冰醋酸水溶液）、不同柱温（30、35、40℃）以及不同流速（0.25、0.30、0.35 mL/min），确定了最终的色谱条件。

本研究在银兰含漱方多成分含量测定和指纹图谱相似度评价的分析基础上，结合PCA模型对银兰含漱方不同批次产品质量的一致性进行分析。第1主成分的方差贡献率达到64.192%，该主成分信息主要来自新绿原酸、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、2号峰和5号峰等成分，这些成分主要来源于金银花、黄芩、甘草3味药材。本方的君药为金银花和黄芩，其中黄芩苷和汉黄芩苷来源于黄芪，而绿原酸非全部来源于金银花。另外，根据PLS‑DA的VIP值分析，黄芩苷和汉黄芩苷的VIP值均大于1，可作为差异标志物，因此本试验只考虑君药黄芪药材的质量对成品的影响。S1~S6的黄芩药材来源于山西省，S7~S15的黄芩药材来源于河北省，根据PCA模型预判，可知2个产地药材之间的差异不大。

本研究指认了隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素9个成分，在专属性考察试验时发现供试品的隐绿原酸、新绿原酸和绿原酸有阴性干扰。因此，在考察质量浓度时只测定甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素6种成分的质量浓度，结果显示黄芩苷的质量浓度最高，而黄芩素和甘草苷的最低，建议不对黄芩素和甘草苷进行质量控制。以15批样品质量平均值的70%~130%设限，暂将含量限度定为甘草苷0.26~0.48 mg/mL、黄芩苷1.47~2.73 mg/mL、汉黄芩苷0.31~0.57 mg/mL、汉黄芩素0.19~0.35 mg/mL。

15批银兰含漱方特征图谱相似度较高，说明制剂工艺稳定；而15批银兰含漱方样品各批次之间的成分含量差异较明显，这可能与投料药材的产地、采收期等因素有关，为了保证成品质量的稳定、可控，必须从原药材的质量出发，建立原药材的入选标准。本研究仅从化学成分层面出发，对银兰含漱方质量进行控制，下一步可结合药理研究，明确其质量标志物，保证产品的安全、有效。