介孔硅纳米颗粒负载氟尿嘧啶用于肝癌和乳腺癌治疗的研究

宋洋，钟克力

近些年，全球生态环境被不断破坏，使得肿瘤的发病率不断提高。肿瘤临床研究表明，肿瘤的死亡率已成为医学界的难题。目前，治疗恶性肿瘤的主要手段是化疗、手术、放疗等。传统化疗容易使体内产生耐药性，以及化疗药物本身也具有毒副作用，严重制约其临床的应用［1-4］。近年来，随着纳米技术的蓬勃发展，纳米载药系统也应运而生。相较于传统化疗，纳米载药系统主要将药物包裹在纳米颗粒内部，减少药物与正常细胞的接触，降低了毒副作用，以及纳米颗粒与生物组织的相容性也有利于肿瘤治疗［5-8］。因此，设计高负载量，低毒性的纳米载药系统是目前肿瘤治疗亟待解决的问题。

在众多纳米载药颗粒中，介孔硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）因其独特的优势而吸引大量科研工作者的关注［9，10］。MSN具有粒径分布均一、水溶性良好、大孔容积等优势。MSN可以在孔道内负载各种荧光材料、化疗药物、蛋白，且具有优良的生物相容性［11-14］。因此，MSN作为优良的纳米载体，广泛应用于肿瘤诊断、治疗等纳米医学领域。5-FU作为一种广谱抗癌药在临床得到应用，但是长期使用可以引起神经毒性等副作用［15-18］，因此怎样合理使用5-FU显得尤为重要。在本课题中，我们利用溶胶-凝胶法合成介孔硅纳米颗粒，然后负载抗肿瘤药物5-FU（MSN@5-FU），通过各种表征手段来检测5-FU的负载情况，最后，我们使用肝癌和乳腺癌细胞来验证MSN@5-FU的抗肿瘤治疗效果。

1 材料与方法

1.1 试剂

原硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU，上海阿拉丁试剂公司）；乙醇、三乙醇胺、盐酸、甲醇、碳酸钠、盐酸（国药试剂有限公司），高糖培养基（DMEM，碧云天公司）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，碧云天公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，碧云天公司）；实验用水为超纯水。

1.2 仪器

JEM-2100HR透射电子显微镜（日本电子JEOL公司）；UVmini-1240型紫外-可见光分光光度计（日本岛津公司）；粒度仪Mastersize 2000（英国马尔文公司）；JSM-6360型扫描电子显微镜（日本JEOL公司）；多标记微孔板检测仪（美国Perkinelmer公司）；冷冻干燥箱（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 MSN@5-FU的制备和载药量

称取CTAB 2.00 g和三乙醇胺80 mg于100 mL三口烧瓶中，加入20 mL去离子水中，冷凝回流，快速磁力搅拌1 h后逐滴加入1 mL TEOS，于90℃快速磁力搅拌反应1 h，得到介孔硅微球。将上述反应产物离心洗涤1次后，加入40 mL甲醇和2 mL浓盐酸于150 mL圆底烧瓶中，接上冷凝回流装置，缓慢磁力搅拌于50℃进行酸醇回流除去模板剂CTAB，反应12 h后更换酸醇回流液后继续除模板反应，重复3次后将产品进行离心洗涤3次，即得到MSN。

称取6 mg MSN加入一定量的5-FU溶液和2 mL PBS缓慢磁力搅拌24 h后用H2O离心洗涤6次，即得到MSN@5-FU，将全部洗涤液收集后进行紫外分光光度计检测265 nm处吸光度值，并通过标准曲线计算出溶液中5-FU的浓度，通过前后计算出MSN@5-FU的载药量和包封率。

1.4 MSN@5-FU的体外释放实验

将5 mg MSN@5-FU分别加入pH 7.4和pH 5.0的PBS 4 mL，置于37℃恒温摇床中以120 r/min的速率持续振摇，在搅拌0、2、4、6、8、12、24和36 h 10000 r/min离心5 min取出上清液1 mL后再加入1 mL PBS继续振摇。并将取出的液体进行紫外分光光度计检测在265 nm处吸光度值，并计算溶液中5-FU浓度。

1.5 肿瘤细胞培养

将4T1（乳腺癌细胞）和HepG2（肝癌细胞）细胞在含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中进行培养（37℃，5%CO2），每两天更换一次培养基，肿瘤细胞通过消化作用进行传代培养。

1.6 RAW 264.7细胞培养

RAW 264.7细胞在含10%的新生小牛血清及100 IU/mL青霉素、链霉素的DMEM高糖培养液中进行培养，培养箱培养条件设定为5%CO2，37℃，隔天换液，每日观察细胞的生长状况。待RAW264.7细胞生长至70%～80%融合度时，弃去旧的细胞培养液，并用PBS洗涤细胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶，弃去消化液，立即加入含10%血清的细胞培养液终止消化，调整细胞至合适密度后接种于新的培养皿中，置于5%CO2，37℃培养箱中培养。

1.7 细胞存活率实验

将两种肿瘤细胞在37℃，5%CO2条件下培养24 h后，加入刚配制的含有MSN@5-FU纳米粒子的悬液，粒子中5-FU浓度分别0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0μg/mL，再继续培养48 h后，加入20μL MTT（5 mg/mL），37℃，5%CO2条件下继续培养4 h。小心吸出上清液后每孔加入0.5 mL PBS洗涤后每孔加入1 mL DMSO，轻轻振摇5 min，用多标记微孔板检测仪在570 nm处测量溶液的吸光度值。MSN的细胞存活率实验类似于上述实验过程。

2 结果

2.1 MSN电镜表征

如图1所示，从透射电镜图中可以看出，制备的MSN分布大量的介孔孔道，且孔道均匀分布，孔径大小相近，可以作为载药的纳米载体。此外，从扫描电镜图中可以看出，制备的MSN大小均一，近似球形，结构规整，粒径分布在120 nm左右。

图1 透射电镜图（A）标尺=50 nm，扫描电镜图（B）标尺=200 nm

2.2 MSN@5-FU粒度仪表征

我们利用粒度仪分别表征载药前后，纳米颗粒粒径变化情况。如图2a所示，载药前后MSN和MSN@5-FU的水合动力学直径没有明显变化，大小在135 nm左右，这个结果和前面的电镜结果相匹配。此外，我们还分析了MSN和MSN@5-FU在稳定性，利用粒度仪检测15天内，二者的粒径变化情况。从图2b中可以看出，MSN和MSN@5-FU在15天内，粒径大小没有发生明显变化，说明制备的材料是优良的纳米载药载体。

图2 MSN和MSN@5-FU粒度仪表征

2.3 MSN@5-FU载药量和包封率

实验分别从载药时间和投料比两个方面来研究MSN@5-FU的载药量和包封率。如图3所示，最佳的载药时间为24 h，当MSN：5-FU=2：1时，其载药量13.6%，包封率为32.3%。上述结果说明MSN@5-FU具有良好的载药能力。

图3 不同时间与投料比下的MSN负载5-FU的载药量与包封率

2.4 体外5-FU累积释放实验

实验利用pH=7.4和pH=5.0两种PBS分别模拟体内生理环境和肿瘤微酸环境。实验结果如图4所示，MSN@5-FU在pH=5.0的PBS条件下，其累计释放量最高可以达到72%，而在pH=7.4的PBS条件下，其最高值不到40%，上述结果说明MSN@5-FU在肿瘤微环境中有利于5-FU的释放。此外，在pH=5.0 PBS条件下，MSN@5-FU在12 h后释放量才达到平台期，而在pH=7.4条件下，4 h左右就达到了一个平台期。结果表明，在肿瘤微环境下，有利于MSN@5-FU实现缓释。

图4 不同p H MSN@5-FU的体外释放动力学曲线

2.5 MSN体外细胞毒性实验

材料应用到细胞实验中，需要考虑其对正常细胞的毒性［19］。实验采用MTT法检测不同浓度MSN对RAW 264.7细胞的毒性。实验中MSN的浓度区间为0～200μg/mL。实验结果从图5中可以看出，在MSN浓度为50μg/mL时，MSN处理的RAW 264.7细胞，其细胞存活率接近100%，几乎没有凋亡。随着浓度的不断增加，细胞存活率也没有明显下降。MSN浓度达到200μg/mL时，细胞存活率仍在90%以上。上述结果表明MSN对正常细胞几乎没有毒性，对正常细胞的影响可以忽略不计，是一种优良的纳米载药载体。

图5 不同浓度MSN的细胞毒性结果

2.6 肿瘤细胞抑制增长实验

实验采用乳腺癌细胞（4T1）和肝癌细胞（HepG2）进行MSN@5-FU抗肿瘤实验。利用MTT法考察不同浓度的MSN@5-FU对两种肿瘤细胞的增长抑制情况。如图6所示，在5-FU浓度为3μg/mL时，MSN@5-FU对两种肿瘤细胞的抑制率分别为18.2%（4T1）和16.6%（HepG2）。此外，从图中可以看出，在5-FU浓度为0.5μg/mL时，MSN@5-FU对4T1和HepG2同样具有一定的抑制作用，随着浓度的不断增加，抑制效果越来越明显。上述结果说明MSN@5-FU对两种肿瘤细胞都有优良的抑制增殖能力，具有一定的普适性，并且具备进行活体实验的潜力。

图6 4T1细胞（a）和Hep G2细胞（b）的细胞存活率结果

3 讨论

本实验设计了MSN负载5-FU的纳米载药系统用于肝癌和乳腺癌的抗肿瘤实验。首先合成了纳米级的MSN材料，通过电镜照片，可以发现材料形貌规整，粒径大小分布均一，孔径分布清晰，孔道完整，并且其制备方法简单，原料便宜，适宜进行大批量生产。合成的MSN@5-FU可以稳定存在，并且MSN：5-FU=2：1时，其载药量13.6%，包封率为32.3%。在肿瘤微环境的pH下，可以大量释放5-FU，并且可以达到缓释的效果。研究发现，MSN@5-FU具有优秀的生物相容性，对正常细胞的毒性可以忽略不计。最后，使用两种肿瘤细胞来评估MSN@5-FU的抗肿瘤活性，发现其具有优良的抗肿瘤能力，未来具有解决化疗药物耐药性的潜力。