Luminal型乳腺癌胞膜蛋白相关预后模型的构建与验证

朱钊雯，贾卫娟，刘洁琼

胞膜蛋白（plasma membrane proteins，PMPs）癌细胞增殖、转移和免疫逃逸等过程有关，随着这些基因表达水平的改变，细胞无限增殖、粘附细胞外基质、侵入血管或淋巴管、于靶器官定植的能力也发生了相应的变化［1-3］。乳腺癌现已成为危害女性健康最常见的癌症［4］，而luminal型乳腺癌占所有乳腺癌的70%以上［5］。

由于PMPs在肿瘤发生发展中经过受体配体结合发挥相应的生物效应，成为许多抗癌药物研发的目标靶点［6］，如多种细胞表面受体和离子通道［7-9］。然而，近来除了CDK4/6抑制剂外，应用于Luminal型乳腺癌的新型PMPs相关治疗靶向有限［10］。同时，鉴于PMPs表达于细胞膜上，便于临床上的定性定量检测，更能快速有效地获取每一位患者的相应肿瘤表达特点，进而运用于临床工作。本研究旨在获得一种有效的Luminal型乳腺癌PMPs相关预后预测模型，同时尽可能为Luminal型乳腺癌患者筛选出潜在的PMPs相关治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 临床样本及数据采集

从TCGA数据库中下载Luminal型乳腺癌转录组RNA测序数据和这些患者的临床信息作为训练集，包括769例Luminal型乳腺癌和111例正常组织样本。排除标准包括：患者①无乳腺癌分子分型信息；②不具备完整的临床数据：包括总生存期（overall survival，OS）、生存状态、诊断年龄、肿瘤大小（T）和淋巴结转移情况（N）。另外，我们从GEO数据库下载了两个微阵列数据集GSE20685和GSE37751中的RNA测序数据及临床信息作为外部验证集。最终，246例Luminal型乳腺癌患者被纳入验证集。同时我们从人类蛋白质图谱数据库中获得了相应的PMPs基因列表。

1.2 训练集差异表达基因分析

利用R软件中Limma包将肿瘤组织与正常组织进行比较，得到所有差异表达基因（deferentially expressed genes，DEGs）和差异表达PMPs（DEPMPs）。筛选条件为logFC＞0.5，P＜0.05。

1.3 PMPs预后模型

首先，将DEPMPs的基因表达量与相应患者的OS和生存状态相结合，筛选出影响预后的DEPMPs，进一步运用多因素Cox回归分析建立PMPs相关预后预测模型。将构建模型中相关基因表达水平与各自的Cox回归系数相乘，得到每个患者的风险评分（RiskScore）根据RiskScore中位数将训练集中的患者划分为高危组和低危组。两组生存差异采用Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验，并计算ROC曲线下面积，验证RiskScore的有效性和预测模型的准确性。

1.4 多基因预后模型验证

利用验证集中246例Luminal型乳腺癌患者的数据验证上述模型的临床有效性。计算风险评分，根据中位风险评分将患者分为高、低风险组，构建K-M生存分析和ROC曲线验证预后预测模型的有效性。

1.5 统计分析

使用R软件通过Survival ROC包计算ROC曲线的AUC以检验预后模型的有效性。对于K-M曲线，通过log-rank和单因素Cox风险回归分析得到95%置信区间的P值和风险比（HR）。所有的统计检验都是双向的。P＜0.05被认为是具有统计学差异的。

2 结果

2.1 筛选差异表达基因DEGs

首先，从训练集中得到所有的DEGs（图1A），进一步发现Luminal型乳腺癌的DEPMPs基因中有59个上调基因和85个下调基因（图1B）。

2.2 预后模型的建立

通过单因素Cox回归分析，从DEPMPs中筛选出30个预后相关基因（图2），进一步通过多变量Cox回归分析，构建出一个包含11个基因的预后预测模型，模型计算公式如下：［ADRA1B的基因表达量*（0.164496）］+［CD99L的基因表达量*（0.35221）］+［EZR的基因表达量*（0.33013）］+［IYD的基因表达量*（0.119785）］+［RGS9BP的基因表达量*（0.125277）］+［SLC16A2的基因表达量*（0.165859）］+［DUS1L的基因表达量*（-0.57798）］+［KIT的基因表达量*（-0.07974）］+［MS4A1的基因表达量*（-0.06685）］+［PI3的基因表达量*（-0.0783）］+［SUSD2的基因表达量*（-0.07928）］。由图2可知，ADRA1B、CD99L2、EZR、IYD、RGS9BP及SLC16A2高表达和DUS1L、KIT、MS4A1、PI3及SUSD2的低表达均与患者预后不良有关。据此计算所有患者的风险评分，根据风险评分中位数将患者分为高危组和低危组（图3A）。同时我们绘制得到了患者的生存状态图（图3B）和11个预后基因的生存热图（图3C）。单因素Cox回归分析显示，包括诊断年龄、分期、T、N在内的临床特征和风险评分都不同程度地影响患者的预后（图4A）。多因素Cox风险回归分析表明诊断年龄、分期和风险评分的P值具有统计学意义（图4B）。为了预测患者的OS，我们得到了高危组和低危组之间的K-M生存曲线，发现高危组的总生存期明显低于低危组（图4C）。此外，风险评分的AUC为0.825，表明该模型可能具有较好的预后预测潜力（图4D）。

图1 DEGs基因（图1A）与DEPMPs基因（图1B）

图2 预后相关DEPMPs基因红色为HR＞1，绿色为HR＜1

2.3 多基因预后模型的验证

利用验证集的RNA测序数据对预后预测模型进行验证，计算验证集中所有患者的风险评分并将患者分为高危组和低危组。结果提示高危组患者预后较低危组差（图5A），且风险评分ROC曲线下面积为0.861（图5B），进一步证明该模型具有一定的临床应用价值。

3 讨论

本研究中，我们建立并验证了可行的Luminal型乳腺癌PMPs预后预测模型。通过分析Luminal型乳腺癌PMPs预后相关基因，我们构建了一个包含高风险相关基因ADRA1B、CD99L2、EZR、IYD、RGS9BP和SLC16A2，以及低风险相关基因DUS1L、KIT、MS4A1、PI3和SUSD2的预后预测模型。

图3 预后模型的特征患者风险评分（图3A）、生存状态图（图3B）和模型中预后基因的生存热图（图3C）

据报道，ADRAIB（肾上腺素受体α1B）增加细胞增殖的同时减少细胞的凋亡，导致较长的肿瘤生存时间和肿瘤复发［11］。CD99L2可以帮助中性粒细胞突破内皮基膜并迁移到炎症组织中［12］。EZR已被证实在多种癌症的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用［13，14］。Ezrin由EZR编码，交联胞膜和构建细胞骨架，Ezrin的磷酸化依赖于TGF-β和MAPK通路的激活，参与癌症的生长和转移，导致疾病进展和低生存率［15，16］。有研究报道IYD能够抑制肝癌细胞糖酵解，进而通过增加有氧糖酵解支持癌细胞的存活和增殖，并导致癌症患者预后较差［17］。RGS9BP在趋化因子诱导的淋巴细胞迁移中发挥作用，负调控naive和调节T细胞迁移的能力，从而影响T淋巴细胞的免疫应答［18］。作为SLC16基因家族中与生存相关的代谢基因，编码MCT8的SLC16A2的表达减少与部分头颈部癌症患者生存的改善相关［19］。

在乳腺癌中，KIT编码的CD117+造血祖细胞，可在肿瘤发生远处转移之前，便被富集至肺部诱导细胞外基质重构，进而为肿瘤的肺部转移与定植提供条件［20］。而在血液系统疾病中，抗人CD117嵌合抗原受体T细胞可有效治疗骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病，这也为乳腺癌肺转移患者的靶向治疗提供了启示［21］。SUSD2编码含822个氨基酸的蛋白，与半凝集素-1相互作用，促进乳腺癌细胞的免疫逃逸与转移、肿瘤血管新生，并显著减少CD4肿瘤浸润淋巴细胞，这表明SUSD2可能是乳腺癌甚至其他癌症的新靶点［22，23］。

图4 模型的预后价值单因素Cox回归分析（图4A）；多因素Cox回归分析（图4B）；高低风险组患者生存曲线（图4C）和ROC曲线（图4D）

图5 预后模型效能的验证：高低风险组患者生存曲线（图5A）和ROC曲线（图5B）

无论在训练集还是验证集中，高危患者的预后都明显较差。进一步采用多因素Cox回归分析，风险评分的AUC均大于0.8。在类似的研究中，肿瘤突变负荷、自噬、不同表达的mRNA或免疫相关预后信号的AUC分别为0705、0.742、0.785、0.83［24，25］。因此，我们的基于11个基因的预后预测模型可能有更好的临床应用潜力，而其中一些基因甚至可能成为有效的治疗靶点。基于11个预后模型相关基因，我们认为可以为深入的实验研究提供一些新的研究思路。

同时，本研究也存在一些局限性。首先，我们还需要更多的功能性实验来探索和验证我们的PMPs预后预测模型的有效性，以及它们是否有可能成为精准治疗的治疗靶点。其次，基于研究现状，我们暂且仅能关注于已被发现及验证的在PM上表达的蛋白质，而不是所有的PMPs。