多孔四氧化三铁靶向递送尼日利亚菌素诱导细胞焦亡联合光热疗法用于三阴型乳腺癌治疗的研究

江伟，潘越，姚和瑞*，胡海*

乳腺癌在临床上根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体-2（Her-2）的表达水平可将乳腺癌分为Luminal型、HER-2过表达型及三阴型3种分子亚型［1，2］。三阴型乳腺癌（TNBC）则因其恶行程度高、疗效差、易转移等特点预后最差［3-5］。相比其它类型乳腺癌，TNBC对靶向Her-2的靶向治疗和内分泌治疗不敏感，而对化疗比较敏感，但尽管如此，化疗的响应人群有限，预后仍然不理想。尽管对于有BRCA突变的患者可以应用PARP抑制剂，但80%以上的TNBC没有BRCA突变。因此寻找一种新型、低毒、高效的治疗策略，对TNBC的治疗有着重大意义。

Fe3O4是一种磁性纳米材料，又名磁铁矿，是唯一一种被FDA批准用于生物医学领域的金属氧化物［6］。Fe3O4已被广泛应用于药物靶向递送、磁共振成像（MRI）造影剂、热疗、DNA或蛋白质分离、生物传感等方向［7-11］。纳米载体药物递送技术正在不断成熟，纳米载药递送技术的成熟为肿瘤的精准靶向治疗提供了可能。而Fe3O4则是靶向性、稳定性良好的药物载体，但目前国内外暂无Fe3O4负载焦亡诱导药物（尼日利亚菌素）的相关研究报道。在我们的研究中合成形貌均一，稳定性好，光热转化性能好的Fe3O4是研究的关键。

细胞焦亡（pyroptosis）作为一种新型的细胞程序性死亡方式，细胞焦亡的现象最早在上世纪90年代由Zychlinsky等［12］在感染志贺菌的小鼠的巨噬细胞中发现，自从被发现以来一直备受关注。细胞焦亡的分子机制可分为依赖于Caspase-1的经典途径和依赖于Caspase-4/5/11的非经典途径［13，14］。Caspase的活化一方面可作用于Gasdermin蛋白，切割该蛋白产生带C端结构域和带N端结构域的两段蛋白，带N端结构域的蛋白最终可与细胞膜结合并导致细胞膜的穿孔，细胞内容物释出［15，16］。活化的Caspase另一方面可促进IL-1β和IL-18前体的成熟，产生成熟的IL-1β和IL-18，随细胞内容物一起释放到胞外，并引起机体的炎症反应［13，17］。细胞焦亡已被证实与慢性炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、艾滋病、肿瘤等多种疾病相关［18-22］。本研究中通过诱导肿瘤细胞发生焦亡的方式来治疗肿瘤可能是将来肿瘤治疗领域的一种潜在的治疗手段。

尼日利亚菌素（nigericin，nig）可以在巨噬细胞中引起细胞焦亡［23］，是一种焦亡诱导药物。但没有相关的研究证明在肿瘤细胞中也能同样诱导发生细胞焦亡，然而nigericin却被证明有抗肿瘤的效果。Liu等［24］证实了nigericin可以通过抑制大肠癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路来达到抑制肿瘤的生长、迁移和侵袭的效果。Hegazy等［25］表示nigericin有抑制癌症干细胞的特性，可诱导mTORC1失活和AMPK磷酸化对人神经胶质瘤产生明显的治疗效果。本研究将从焦亡的角度来探索nigericin和肿瘤的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 小鼠乳腺癌细胞4T1购于ATCC细胞库。Fe3O4纳米粒子（合成），尼日利亚菌素-Nigericin（InvivoGen公司）。

1.1.2 仪器 水热釜（上海新诺仪器集团有限公司），电动搅拌器（常州方科仪器有限公司），磁力搅拌器（德国IKA艾卡公司），高分辨透射电镜（美国FEI公司），q-PCR仪（罗氏公司），酶标仪（TECAN，瑞士帝肯）。

1.1.3 试剂 CCK-8试剂盒（APExBIO公司），RPMI-1640培养基（GIBCO公司），南美特级胎牛血清FBS（Biological Industries），双抗——青霉素、链霉素（New Cell&Molecular Biotech），胰酶（GIBCO公司），PBS缓冲液（GIBCO公司），兔抗鼠N-GSDMD单抗（Abcam公司），HRP标记的抗兔IgG单抗（Cell SignalingTechnology公司），ECL超敏发光液（ABPBiosciences公司），RNA快速提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司），5×PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa公司），SYBR Premix Ex TaqⅡ2×（TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4纳米粒子的制备 FeCl3·6H2O（1.08 g，4 mmol）、柠檬酸钠（C6H5O7Na3·2H2O）（2.35 g，8 mmol）和尿素（0.72 g，12 mmol）缓慢的溶解到80 ml的蒸馏水中，搅拌混合均匀后，然后再加入聚丙烯酰胺（0.6 g）（在搅拌的过程中缓慢加入），用磁力搅拌器剧烈的搅拌1 h。得到的混合溶液转移到不锈钢高压釜中，并在200℃保温12 h。用乙醇和去离子水的混合溶液将产物洗涤三次，洗涤后常温真空干燥，得到固体产物，该产物不会团聚，能很好地再次溶于水溶液中，置于干燥器中保存。

1.2.2 Fe3O4纳米粒子的物理表征 透射电镜拍摄：将Fe3O4纳米粒子加入纯水中，超声分散5 min使其在水中充分分散均匀，取1滴溶液滴在透射电镜的铜网上，室温静置10 min，并放置恒温烘箱中烘干，水分烘干后放置透射电镜下观察Fe3O4纳米粒子的形态。

1.2.3 Fe3O4纳米粒子负载nigericin 称取10 mg Fe3O4于5 mL EP管A，加入2.5 mL DMSO，高功率超声5 min至完全分散，称取50 mg nigericin于另一5 mL EP管B，称取5 mg多巴胺（PD）于另一5 mLEP管C中。

将溶解有Fe3O4的DMSO加入EP管B中，高功率超声5 min至完全分散，并将混合溶液转移至新的50 mL离心管中，在超声振荡下，往离心管中逐滴滴入20 mL Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH=8.8），使溶液处于碱性环境，继续超声5 min。

往管C中加入2.5 mL纯水溶解多巴胺，加入上述50 mL离心管中将溶液混合均匀，使用搅拌器搅拌3 h，可见溶液颜色变成黑色，得到负载完成后的Fe3O4@nigericin混合溶液。负载完成后将溶液进行分装成10等份，以供后续实验使用。

1.2.4 Fe3O4纳米粒子的光热性能验证 配制不同浓度0μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL的Fe3O4溶液，连接好808 nm激光（NIR）发射器，连接好光热成像仪，将激光器功率调节至1 W/cm2，对准Fe3O4溶液上方进行激光照射10 min，利用光热成像仪进行拍摄记录温度。

1.2.5 Fe3O4纳米粒子的生物相容性测定 将培养的4T1细胞消化下来种于96孔板，使每孔细胞数量为1000个，共设置6组，每组4～5个复孔，96孔板孔内细胞长至50%后，弃去上清，6组分别加入终浓度含0μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL的Fe3O4溶液，置于培养箱培养24 h后，加入CCK8工作液，孵育2 h后，用酶标仪450 nm波长处检测OD值。

1.2.6 细胞杀伤能力测定 将培养的4T1细胞消化下来种于96孔板，使每孔细胞数量为1000个，共设置6组，每组3个复孔，96孔板孔内细胞长至50%后，弃去上清，6组分别加入完全培养基，终浓度分别含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液，200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液（12 h时予以808 nm激光照射10 min）。培养至12 h时，第6组进行80 nm激光照射，每孔10 min，并继续培养至24 h，再加入CCK8工作液，孵育2 h后，用酶标仪450 nm波长处检测OD值。

1.2.7 细胞焦亡验证

1.2.7.1 GSDMD蛋白western-blot 将培养的4T1细胞消化下来种于细胞培养皿中，共设置6组，6组分别加入完全培养基，终浓度分别含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液，200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液（12 h时予以808 nm激光照射10 min）。培养至12 h时，第6组进行808 nm激光照射10 min，并继续培养至24 h，用ripa裂解液裂解细胞收取蛋白，并用BCA试剂盒测蛋白浓度，加入loading buffer煮沸10 min使蛋白变性，根据所测浓度等蛋白质量上样，进行电泳，电泳完成后转膜2 h，转膜结束后使用5%的牛奶进行封闭1 h，TBST洗干净牛奶后进行一抗孵育4度过夜，次日再用TBST清洗3遍，使用二抗孵育1h，再用TBST清洗3遍，进行ECL发光。

1.2.7.2 IL-1β、IL-18基因q-PCR 将培养的4T1细胞消化下来种于细胞培养皿中，共设置6组，6组分别加入完全培养基，终浓度分别含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液，200μg/mL Fe3O4@nigericin溶液（12 h时予以808 nm激光照射10 min）。培养至12 h时，第6组进行808 nm激光照射10 min，并继续培养至24 h，使用RNA快速提取试剂盒提取RNA，所得RNA进行测浓度，并根据浓度进行逆转录。所得c-DNA使用引物进行扩增，通过2-ΔΔct法计算各组的相对表达量。各引物序列为actin-F：CTCTCCCTCACGCCATC；actin-R：ACGCACGATTTCCCTCTC；IL-18-F：AAAGTTAGGTGGGGAGGGT；IL-18-R：CAGCCTCGGGTATTCTGTT；IL-1β-F：TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG；IL-1β-R：AGGTCCACGGGAAAGACACAGG。

1.3 统计学分析

利用IBM SPSSStatistics 25.0对实验数据进行统计学分析，计量资料以平均值±标准差（SD）的形式表示，通过单因素方差分析对多组数据进行比较，进而使用LSD方法比较两两比较。当统计结果P＜0.05时认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 Fe3O4纳米粒子的物理表征

利用FeCl3·6H2O、柠檬酸钠和尿素合成的Fe3O4纳米颗粒，通过透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察到的结果为图1a和b，显示其纳米颗粒整体外观形态规则、呈现为球形，大小一致、分散均匀、无团聚现象，通过比例尺测量其粒径约为240～250 nm，纳米颗粒的内部有光线透过，表示其为内部多孔结构。在观察Fe3O4纳米颗粒具有良好的形貌后，我们将其与nigericin混合负载，并在其外表面包裹一层盐酸多巴胺，完成后再次拍摄透射电镜，观察到的结果为图1c和d，可以看出负载药物后Fe3O4纳米粒子的形态未发生变化，外观仍然呈现球形，并在其外表面形成了一层膜包裹住了纳米颗粒，通过比例尺测量其粒径约为310～320 nm。

图1 A：Fe3O4的TEM图；B：Fe3O4的TEM图（放大后）；C：负载后Fe3O4的TEM图；D：负载后Fe3O4的TEM图（放大后）

2.2 Fe3O4纳米粒子的光热实验

纳米材料的光热转化性能决定着光热疗法的效果，因此对合成的Fe3O4纳米颗粒进行光热性能测定，将Fe3O4纳米颗粒溶解于纯水中，配制不同浓度25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的Fe3O4溶液，在808 nm激光器下照射10 min，并记录温度变化，图2的结果显示，808 nm的激光照射可以很好地使Fe3O4溶液升温，200μg/mL的Fe3O4溶液4 min左右即可使溶液升至40℃以上，其升温效率呈浓度和时间依赖性，具有良好的光热转化性能。

图2 不同浓度Fe3O4溶液808 nm激光照射升温曲线

2.3 Fe3O4纳米粒子的生物相容性

纳米材料的毒性往往限制了纳米材料的生物应用，良好的生物相容性是其在生物体中应用的前提。测定合成的Fe3O4纳米颗粒的生物相容性，将Fe3O4纳米颗粒溶解于纯水中，配制不同终浓度25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的Fe3O4溶液，并将不同浓度的Fe3O4溶液加入至培养好的4T1细胞中，共培养24 h，测定细胞的存活率。图3的结果显示，尽管随着Fe3O4溶液浓度的增加，细胞的存活率略有降低，但最高浓度200μg/mL的Fe3O4溶液与细胞共培养后，细胞的存活率仍然接近90%以上，可认为其对细胞的毒性很小。

图3 不同浓度Fe3O4溶液对4T1细胞存活率影响

2.4 细胞杀伤能力测定

在验证了Fe3O4纳米颗粒的良好的生物相容性和光热转化性能后，我们将其应用于细胞实验，我们配制了对应的不同终浓度的负载药物后的Fe3O4@nigericin溶液，与4T1细胞进行共培养，并对其进行808 nm激光照射，测定细胞的存活率（图4a），并计算了其对细胞的抑制率（图4b）。结果显示与图3结果对比，细胞存活率明显下降，证实了nigericin联合光热疗法对4T1细胞有很好的杀伤效果（P＜0.001）。

2.5 GSDMD蛋白western-blot

在证实nigericin联合光热疗法具有很好的细胞杀伤性能后，我们通过western-blot来验证细胞在被杀伤过程中是否发生了焦亡。我们在培养的6组细胞中分别加入完全培养基、终浓度分别含5μg/mLnigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin（12 h时予以808 nm激光照射10 min），24 h后收取蛋白样品进行western-blot实验，孵育兔抗鼠N-GSDMD单抗。图5的结果显示在加入nigericin和进行了光热治疗后，N-GSDMD的表达量明显增加，细胞焦亡得到了增强，在蛋白水平证实了细胞焦亡在细胞杀伤中发挥了重要作用。

图4 A：不同浓度Fe3O4负载药物后联合808 nm激光对4T1细胞存活率影响；B：不同浓度Fe3O4负载药物后联合808 nm激光对4T1细胞的抑制率。

2.6 IL-1β、IL-18基因q-PCR

除了蛋白水平的验证，我们还验证了焦亡细胞释放的炎症介质IL-1β、IL-18的基因水平的变化，在培养的6组细胞中分别加入完全培养基、终浓度含5μg/mL nigericin、10μg/mL nigericin、15μg/mL nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin、200μg/mL的Fe3O4@nigericin（12 h时予以808 nm激光照射10 min），24 h后收取RNA，逆转录后进行q-PCR扩增验证，图6的结果显示对比NC组，在加入nigericin和进行了光热治疗后，IL-1β、IL-18基因的表达都有相应的增加（P＜0.01），此结果与蛋白表达水平的趋势大基本一致。

3 讨论

图5 A：不同处理因素作用细胞后GSDMD蛋白的表达水平；B：western-blot实验结果灰度分析柱状图

图6 A：不同处理因素作用细胞后IL-1β基因的相对表达量；B：不同处理因素作用细胞后IL-18基因的相对表达量

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率正逐年升高，发病人群也在逐渐年轻化，其中三阴型乳腺癌多发生于绝经前女性，其在所有乳腺癌中占15%左右［26，27］，多为中晚期乳腺癌（Ⅲ-Ⅳ），且死亡率高，在Afshin Rakhsha的研究中报道，TNBC的Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者5年总生存率分别为92.3%、86.5%、57.8%和9%［28］。因此鉴于传统疗法对TNBC的疗效差的现状，寻找一种新型、高效、低毒的疗法是提高TNBC生存率的关键。本研究结果表明Fe3O4负载nigericin联合光热疗法对小鼠三阴型乳腺癌4T1细胞具有明显的杀伤作用。

纳米材料在生物医学领域有了多方面的应用，但往往纳米材料的生物相容性制约了其的进一步应用。纳米材料的毒性机制仍未十分清楚［29］，但生物相容性差的纳米材料会损伤体内的正常组织及细胞。Chu［30］等人的研究发现二氧化硅纳米颗粒可以通过非特异性内吞作用进入细胞中被膜包被的细胞器中，从而影响细胞器的功能而产生毒性。Annangi［31］等人研究了氧化锌对野生型小鼠胚胎成纤维细胞的毒性影响，发现仅仅1μg/mL氧化锌即可在细胞中诱导ROS产生，进而损伤细胞的DNA。Hu［32］等人研究了氧化石墨烯纳米片对A549细胞的影响，发现氧化石墨烯纳米片可以直接与细胞膜相互作用对细胞膜产生物理损伤。我们的研究结果显示，在Fe3O4浓度高达200μg/mL时细胞的存活率仍然接近90%，因此可认为合成的Fe3O4在不高于200μg/mL的浓度内细胞毒性很低，具备良好的生物相容性。

已有研究报道Fe3O4具有良好的光热转化性能，可用作光热治疗的光热转化剂。在Lu［33］等的Fe3O4/Au DSNFs多模态成像指导的乳腺癌治疗的研究中，他们所设计的Fe3O4/Au DSNFs比游离的USIONPs有着更高的光热转换效率（82.7%）。Ge等［34］人的研究表明Fe3O4-R837 SP可以通过PTT激活体内先天免疫系统和适应性免疫系统来显着增强PD-L1的全身治疗效率。Yuan等［35］人在Fe3O4的表面包裹一层PEG分子形成了PEG-Fe3O4复合物，通过激光照射可明显抑制C6细胞的活力，表明了其优秀的光热抗癌功效。本研究的结果显示我们合成的Fe3O4具有良好的光热转化性能，与相关的文献的报道一致。

目前已有一系列最新研究揭示了焦亡和免疫与肿瘤有着密不可分的关系。邵峰院士团队［36］的另一重大发现揭示了细胞毒性淋巴细胞在发挥其作用杀伤靶细胞的过程中产生的Granzyme A可以裂解激活GSDMB，导致靶细胞焦亡，该免疫机制可以促进小鼠中CTL介导的肿瘤清除。Zhang等［37］的研究表明GSDME的表达可以增强肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，同时增强肿瘤浸润性自然杀伤细胞和CD8+T的功能和增加其数量，该分子机制可能与肿瘤抑制相关。本研究的结果证实了我们的联合治疗模式是通过细胞焦亡的机制杀伤肿瘤细胞。然而本研究的实验结果仅限于体外细胞实验，在机体内是否同样有较好的疗效以及是否能通过释放某种炎症因子激活机体的免疫反应，有待进一步的动物实验的验证。

综上所述，Fe3O4负载nigericin联合光热疗法可以诱导小鼠三阴型乳腺癌4T1细胞发生焦亡以达到治疗TNBC的目的。本研究的相关结果能为该方向的研究提供重要的参考价值，对改善TNBC治疗的现状提高TNBC的生存率具有重要的意义。