分子对接和光谱法研究原儿茶醛和阿魏酸与牛血清白蛋白的互作机理

吕艳芳，梁倩倩，郭雨晴，李学鹏，刘欣欣，沈 琳，励建荣,

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.上海交通大学分析测试中心，上海 200240；3.大连东霖食品股份有限公司，辽宁 大连 116007）

多酚是指存在于植物体内、化学结构中包含多个酚羟基的一类化合物的总称。多酚类物质是重要的功能性成分，具有抗氧化、抗菌和抗癌等多种功能，而这些功能可能是由于多酚与体内的蛋白质、脂质等靶分子直接或间接相互作用所致[1]。目前，关于多酚的研究报道有很多，Chen Xiaowei等[2]研究了芦丁对大豆蛋白界面性能和乳液稳定性的影响。黄渊等[3]分别研究了白藜芦醇、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）和没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）对鲢鱼肌球蛋白（silver carp myosin，SCM）空间结构的影响。

原儿茶醛（protocatechuic aldehyde，PCA）的结构如图1A所示，化学名称为3,4-二羟基苯甲醛，多见于乌蕨、四季青和丹参的根叶部，具有多种生理活性。近年来，对于PCA的研究主要集中在医药领域。祝友文等[4]和高丽[5]分别研究发现PCA对环磷酰胺引起雄性小鼠的生殖损伤和顺铂介导的小鼠急性肾脏损伤具有保护作用。张寒等[6]发现PCA具有舒张血管的功能。另外，PCA也是合成其他香料和药物的中间体[7]。PCA由于具有邻二酚母核结构而展现出显著的抗氧化活性，Bountagkidou等[8]通过研究添加5 种天然多酚防腐剂的木桶装红酒的抗氧化活性，发现只有PCA在所有测定环境中均对红酒表现出高抗氧化活性，因此有望将其用作食品抗氧化剂，但目前PCA在食品领域的研究及应用都比较少，这可能与其作用机制不明有一定关系。

图1 PCA（A）、FA（B）结构式Fig.1 Chemical structures of PCA (A) and FA (B)

阿魏酸（ferulic acid，FA）的结构如图1B所示，化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，主要存在于麦麸等谷物和川芎等中草药中。FA的热稳定性和化学稳定性良好，且毒性较低，又因其具有良好的药理作用和生物活性，越来越多的国家开始将其用于食品、医药等各个领域。李黎云[9]发现在待宰育肥猪的日粮中添加FA，会增加猪肉产品的嫩度，且延长保质期。魏延玲等[10]发现，FA能够抑制风干鲈鱼中N-二甲基亚硝胺的生成以及微生物的生长繁殖，并能有效清除鲈鱼中残留的亚硝酸盐，从而降低人类患高血压、癌症等疾病的机率。饶文婷等[11]发现FA能够调节肠道菌群。近年来，FA的多功能性使其成为食品添加剂领域的研究热点[12]，因此对其作为食品添加剂的安全性进行评估至关重要，通过研究FA与生物大分子的相互作用，从而深入理解FA结构变化对其毒理性质和功能特性的影响，对新型天然食品添加剂的开发有重要的意义。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血液中的多功能转运蛋白，能可逆结合小分子物质并将其运送到人体需要的各个部位。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在序列和构象上与HSA具有高度同源性和相似性，且价格相对比较便宜，因此被广泛应用于小分子物质与血清蛋白的研究中[13]。随着计算机模拟技术的迅速发展以及更多蛋白质三维结构的解析，分子对接已经成为研究小分子物质与蛋白质相互作用的重要手段。Cheng Hao等[14]应用光谱法结合分子对接技术对比研究了顺式、反式白藜芦醇与BSA的相互作用。Das等[15]应用该技术研究了EGCG与牛血红蛋白（hemoglobin，HGB）的相互作用。

利用分子对接技术研究蛋白质与多酚间的相互作用，并同光谱实验的结论进行分析、比较从而互相验证、补充，进而能够从实验和理论研究其相互作用。目前，关于PCA和FA与大分子相互作用的机理研究较少，并且在食品领域的应用范围也较小，为使其在食品加工、贮藏保鲜等多个领域中像EGCG、茶多酚和白藜芦醇等多酚一样被广泛应用，本实验应用紫外光谱、荧光光谱、同步荧光光谱以及分子模拟技术综合分析PCA和FA与BSA相互作用的机制，有助于在分子水平上了解其与蛋白质的相互作用，最终为PCA和FA在食品领域的广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PCA、FA（纯度≥99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BSA（纯度≥98%） 美国Sigma公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MS105DU电子分析天平、FiveEasy Plus FE28 pH计瑞士梅特勒-托利多公司；KX-1990超声波清洗仪 北京科玺有限公司；DK8D电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；UV2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；FluoroMax-4荧光光度计 法国HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外光谱法测定PCA和FA与BSA的相互作用

于7 支试管中分别移取质量浓度2.5×10－3g/mL的BSA溶液0.5 mL和浓度为1.0×10－4mol/L的PCA、FA溶液分别0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，最后用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.067 mol/L，pH 7.4）稀释，使多酚的终浓度分别为0、5×10－6、10×10－6、15×10－6、20×10－6、25×10－6、30×10－6mol/L，BSA终质量浓度为2.5×10－4g/mL，充分混匀后，于298 K静置10 min，使用紫外分光光度计进行光谱扫描200～800 nm的范围，以浓度为0 mol/L的PCA、FA溶液作为对照。

1.3.2 荧光光谱法测定PCA和FA与BSA的相互作用

取3 组试管，每组8 支，分别加入质量浓度为2.5×10－3g/mL的BSA溶液0.5 mL和1.0×10－4mol/L的PCA、FA溶液分别为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL，以PBS（0.067 mol/L，pH 7.4）定容，使多酚终浓度分别为0、5×10－6、10×10－6、15×10－6、20×10－6、25×10－6、30×10－6、35×10－6mol/L，BSA终质量浓度为2.5×10－4g/mL，充分混匀后，将第1组混合溶液于298 K静置10 min，第2组于310 K恒温水浴10 min，第3组于320 K恒温水浴10 min，使用荧光光度计进行光谱扫描，在激发波长281 nm、狭缝宽度5 nm、扫描范围280～450 nm的条件下检测，并以PCA、FA浓度均为0 mol/L的溶液作为对照。

1.3.3 荧光猝灭计算

通过Stern-Volmer方程（1）计算猝灭常数的变化，以判断PCA和FA对BSA的荧光猝灭类型；采用双对数方程（2）计算PCA和FA分别与BSA相互作用的结合常数Ka和结合位点数n；使用热力学方程（3）和（4）计算PCA和FA分别与BSA相互作用的热力学参数[16]。

式中：F0为对照组的荧光强度；F为PCA和FA浓度为Q时BSA的荧光强度；[Q]为PCA和FA的浓度/（mol/L）；Ksv为动态猝灭常数/（L/mol），可由F0/F对[Q]的斜率求得；Kq为猝灭速率常数/（L/（mol·s））；τ0为猝灭剂不存在时生物大分子的平均荧光寿命（约为10－8s）；ΔG为自由能变/（kJ/mol）；ΔH为焓变/（kJ/mol）；ΔS为熵变/（J/（mol·K））。

1.3.4 同步荧光光谱法测定PCA和FA与BSA的相互作用

BSA和多酚溶液处理方法同1.3.1节所叙述的方式。以波长差（Δλ）分别为15 nm和60 nm、狭缝宽度：1 nm、扫描范围：200～400 nm的条件进行同步荧光检测。

1.3.5 分子对接

从PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb）搜索ID编号：“4F5S”的BSA晶体结构并下载[17]，利用PyMol软件对BSA进行去亚基、去水和删除小分子配体等操作，并保存成PDB格式；从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取PCA（CID：8768）和FA（CID：445858）的二维结构[18]，运用ChemDraw软件对其进行能量优化并保存成PDB格式，然后利用AutoDock软件对BSA、PCA和FA进行加氢、计算电荷等前处理步骤后，保存成PDBQT格式，最后使用AutoDock-vina软件进行分子对接，对接结果采用Discovery Studio 2017 R2 Client、PyMol软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 PCA和FA与BSA相互作用的紫外光谱分析

298 K时不同浓度的PCA和FA分别与BSA相互作用的紫外光谱结果如图2所示，当PCA和FA为0 mol/L时，BSA在276 nm波长处有一强吸收峰，这主要是由BSA的酪氨酸（tyrosine，Tyr）、色氨酸（tryptophan，Trp）残基的苯环π→π*跃迁产生[19]。PCA和FA浓度在0～30×10－6mol/L的范围时，随着PCA和FA浓度的增加，BSA在276 nm波长处的吸收峰强度不断增大，且波长从276 nm红移至280 nm，说明PCA和FA的加入使BSA分子内部的Trp、Tyr残基裸露于水相中，疏水残基间的疏水作用力减弱，从而与BSA形成复合物，导致BSA的共轭程度增强，产生了新的π→π*跃迁，最终引起BSA紫外吸收强度增大，吸收峰红移[20]。动态猝灭不引起蛋白质吸收峰波长改变，而静态猝灭则会导致吸收峰波长改变[21]。因此，初步判断PCA和FA对BSA的猝灭过程均为静态猝灭。

图2 298 K时PCA（A）、FA（B）与BSA相互作用的紫外吸收光谱Fig.2 UV absorption spectra of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at 298 K

2.2 PCA和FA与BSA相互作用的荧光光谱分析

298、310、320 K时，不同浓度的PCA与BSA相互作用的内源荧光光谱如图3所示，当激发波长为281.0 nm时，BSA分别在347.0、349.0、345.0 nm波长处有1 个强荧光发射峰。Aprodu等[22]发现，Trp的最大荧光发射波长（λem）在308.0～352.0 nm范围内，而Tyr的最大荧光发射波长为304.0 nm，因此可以推断BSA的内源荧光主要来源于Trp残基。由图3、4可知，PCA和FA浓度在0～35×10－6mol/L时，随着PCA和FA浓度的增加，3 种温度下的BSA内源荧光强度都呈下降趋势，说明PCA和FA都可以与BSA结合，使其内源荧光发生猝灭。BSA的内源荧光猝灭程度随着FA、PCA各自浓度增加而加剧，且PCA对BSA的猝灭效果比FA更明显，其可能是因为PCA和FA结合在BSA的Trp134残基或Trp213残基附近。沈亮亮[23]利用荧光光谱法研究苦丁茶中紫茎女贞苷A和紫茎女贞苷B与BSA的相互作用时发现，紫茎女贞苷A对BSA内源荧光的猝灭效果比紫茎女贞苷B更明显，说明紫茎女贞苷A更接近BSA的Trp残基。由此可以推测，PCA和FA分别与BSA作用时，PCA距离BSA的Trp134或Trp213残基更近一些。如图3所示，随着PCA浓度的增大，BSA的最大荧光发射波长发生明显红移，其在298 K时从347.0 nm红移到366.5 nm；其在310 K时从349.0 nm红移到366.5 nm；其在320 K时从345.0 nm红移到367.0 nm。由图4可知，随着FA浓度的增大，BSA的最大荧光发射波长也发生明显红移，其在298 K时从347.0 nm红移到351.0 nm；其在310 K时从349.0 nm红移到350.0 nm；其在320 K时从345.0 nm红移到349.0 nm，此结果说明PCA和FA的加入均会使BSA的Trp134或Trp213残基周围的极性增强，疏水性减弱，表明Trp134残基或Trp213残基逐渐从BSA内部的疏水环境中暴露出来、肽链逐渐伸展、发生去折叠现象[24]，也说明PCA、FA对BSA的猝灭均可能是静态猝灭。另外，比较BSA分别与PCA和FA结合后最大荧光发射波长的变化，可以发现BSA与PCA相互作用后的最大荧光发射波长红移更明显，这可能与其结构有关，PCA的分子质量低于FA的分子质量，且PCA比FA多1 个酚羟基，所以极性更大的PCA可更大程度地增强Trp134残基或Trp213残基周围的极性，使BSA的肽链更加伸展，从而更深入地插到BSA的疏水区域中[23]。

图3 不同温度下PCA与BSA相互作用的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of PCA-BSA interactions at different temperatures

图4 不同温度下FA与BSA相互作用的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of FA-BSA interactions at different temperatures

2.3 荧光猝灭机理

2.3.1 PCA和FA对BSA的荧光猝灭类型

298、310、320 K时，PCA和FA与BSA相互作用的Stern-Volmer拟合结果如图5所示，F0/F和[Q]之间存在良好的线性关系。PCA和FA与BSA相互作用的Ksv、Kq值如表1所示，随着温度从298 K升高到320 K，PCA与BSA相互作用的Ksv值从1.015×105L/mol减小到6.939×104L/mol，FA与BSA相互作用的Ksv值从4.863×104L/mol减小到3.430×104L/mol，而且在不同的温度条件下，PCA和FA与BSA相互作用的Kq值均远大于最大动态猝灭速率2.0×1010L/（mol·s）[25]，说明PCA和FA都分别与BSA形成了大分子复合物，且其均为静态猝灭过程[17]。此外，在同一温度下，PCA与BSA相互作用的Kq值均大于FA与BSA相互作用的Kq值，因此与FA相比，PCA对BSA的内源荧光猝灭程度更大。

图5 不同温度下PCA（A）和FA（B）与BSA相互作用的Stern-Volmer拟合图Fig.5 Stern-Volmer plot of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

表1 不同温度下PCA和FA与BSA相互作用的猝灭常数Table 1Quenching constants for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

2.3.2 PCA和FA与BSA相互作用的结合常数和结合位点数

298、310、320 K时，PCA和FA与BSA相互作用的双对数结果如图6所示，PCA和FA与BSA相互作用的Ka、n值如表2所示，随着温度从298 K升高到320 K，PCA与BSA相互作用的Ka值从1.011×106L/mol减小到1.818×105L/mol，FA与BSA相互作用的Ka值从8.322×105L/mol减小到4.881×104L/mol，均达到104数量级，说明PCA和FA与BSA相互作用的荧光猝灭类型均以静态猝灭为主、动态猝灭可忽略不计，进一步说明PCA和FA均能与BSA形成稳定的复合物[26]，其与2.1、2.2、2.3.1节所得结论一致。不同温度条件下，PCA和FA与BSA相互作用的n值均接近1.000，说明PCA和FA与BSA的结合比例约为1∶1。此外，温度相同时，PCA与BSA相互作用的Ka值均大于FA与BSA的Ka值，说明PCA与BSA之间的结合力大于FA与BSA的结合力，这可能是因为PCA的极性强于FA的极性。杨淑玲等[27]研究发现，在36～37 ℃时黄体酮（progesterone，PROG）与BSA相互作用的Ka值为1.423×104L/mol，推测PROG进入人体后能与HSA较好地互作，从而被HSA运输到靶器官。310 K时PCA、FA与BSA相互作用的Ka值分别为9.005×105、2.553×105L/mol，远大于104L/mol，因此也可推测，PCA和FA均能与HSA在人体环境中进行较好地相互作用，且PCA比FA更容易被HSA贮存、运输。

图6 不同温度下PCA（A）和FA（B）与BSA相互作用的双对数图Fig.6 Double logarithmic plots for PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

表2 不同温度下PCA和FA与BSA相互作用的结合常数和结合位点数Table 2Binding constants and binding site numbers for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

2.3.3 PCA和FA与BSA相互作用的作用力类型

PCA和FA与BSA相互作用的ΔG、ΔH、ΔS值如表3所示，在298、310、320 K共3 种不同温度条件下，PCA和FA与BSA相互作用过程中的ΔG均小于0，说明PCA和FA与BSA的结合过程是自发进行的。PCA与BSA相互作用的ΔS、ΔH值分别为－107.186 J/（mol·K）、－67.088 kJ/mol，FA与BSA相互作用的ΔS、ΔH值分别为－284.251 J/（mol·K）、－23.332 kJ/mol，其均小于0，说明PCA和FA与BSA相互作用过程中的主要作用力均为氢键和范德华力[28]。这与吴雨杭[29]研究染料木素、金雀花碱与BSA分别相互作用过程和黄朝波等[18]研究红斑红曲胺与BSA相互作用过程的作用力一致。

表3 PCA和FA与BSA相互作用的热力学参数Table 3Thermodynamic parameters for PCA-BSA and FA-BSA interactions

2.4 PCA、FA与BSA相互作用的同步荧光光谱分析

同步荧光常用来分析小分子物质对蛋白质构象的影响，Δλ1=15 nm和Δλ2=60 nm时，同步荧光光谱分别显示蛋白质中Tyr、Trp残基的特征信息[30]。由图7A、8A可知，随着PCA和FA的加入，Tyr残基的荧光发生略微蓝移，说明PCA和FA会使Tyr残基周围的极性降低，疏水性增强[3]；由图7B、8B可知，随着PCA的加入，Trp残基的荧光基本未发生移动；而FA的加入，使Trp残基的荧光发生略微红移，说明FA使Trp残基周围的极性增加，疏水性减弱。由图7、8可知，BSA中的Tyr、Trp残基分别在303、346 nm处有最大特征吸收峰，Trp的荧光强度远大于Tyr，其对应关系约为10∶1，这主要是因为蛋白质中荧光强度比约为Trp∶Tyr∶Phe=100∶9∶0.5[18]。随着PCA和FA浓度的增加，Tyr和Trp的荧光均呈现降低趋势，且Trp的荧光猝灭效率大于Tyr的荧光猝灭效率，结合2.2节得出的结论：加入PCA和FA导致BSA的内源荧光红移现象的发生，可以推断PCA和FA导致BSA发生荧光猝灭的主要原因是Trp残基的荧光发生了猝灭。庹浔等[31]研究发现，小分子物质与主要结合在BSA的IIA或IIIA结构域中，IIA结合域含有Trp213、Tyr262残基，IIIA结构域含有Tyr400、Tyr410、Tyr451、Tyr496残基。2.3.2节发现，PCA和FA与BSA均只有1 个结合位点，结合同步荧光的结果，PCA和FA使BSA荧光发生猝灭的原因主要是导致Trp残基的荧光发生猝灭，推测PCA和FA与BSA的结合位点可能在IIA结构域的Trp213残基附近。

图7 PCA与BSA相互作用的同步荧光光谱及λem的变化Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of PCA-BSA interactions and λem shift

图9、10分别为PCA、FA与BSA相互作用的分子模拟结果图，结合能量分别为－5.1、－6.3 kcal/mol。由图9A可知，PCA与BSA形成了4 个常规氢键（O···H—X），其包括：PCA酚羟基的氢与Asp450的羧基氧形成氢键，键长为3.04 Å；PCA的2 个酚羟基氧与Ser343侧链的羟基的氢分别形成2 个氢键，键长分别为4.31、4.32 Å；PCA醛基的氧与Trp213吲哚基上的氨基的氢形成氢键，键长为5.12 Å，这4 个氢键加强了相互作用过程中非共价结合的强度，稳定了PCA与BSA复合物的空间构象[32]。同时，PCA的苯环与BSA的疏水性氨基酸Val342的丙基侧链形成了疏水键，键长为5.03 Å，有利于维持PCA和BSA作用部位的空间构象。另外，PCA的苯环分别与Arg194带正电荷的胍基和Asp450带负电荷的羧基基于π-阳离子和π-阴离子作用而结合，键长分别为6.30、4.07 Å。此外，PCA与BSA的Leu197、Arg198、Ala341、Glu449、Ser453、Leu454残基形成了范德华力，也对复合物的空间构象有很大的支持作用。

图8 FA与BSA相互作用的同步荧光光谱及λem的变化Fig.8 Synchronous fluorescence spectra of FA-BSA interactions and λem shift

图9 PCA与BSA相互作用的分子对接图Fig.9 Molecular docking diagram of PCA with BSA

2.5 分子对接结果分析

由图9A、10A可知，PCA和FA主要靠氢键和范德华力与BSA结合，与2.3.3节所得结论一致。由图9B、10B可知，PCA和FA在BSA上的最佳结合位点在IIA结合域和IIIA结合域之间，且距离IIA结合域更近，这与2.4节的推测一致。PCA和FA分别与Trp213靠氢键作用而结合，如图9D、10D所示，其结合在Trp213及其周围的疏水性残基形成的疏水口袋中，此现象解释了PCA和FA导致BSA内源荧光发生猝灭的原因，进一步验证了光谱实验的结论。另外，由图9A、10A还可知，PCA比FA距离BSA的Trp213更近，其对应关系为0.512 nm＜0.518 nm，根据Forster[33]的非辐射能量转移机理可知，虽然PCA和FA均可被BSA贮存、转运，但PCA更容易被BSA贮存并运输。

图10 FA与BSA相互作用的分子对接图Fig.10 Molecular docking diagram of FA with BSA

由图10A可知，FA与BSA分子形成了4 个常规氢键（O···H—X）包括：FA的羧基氢与Val481的羧基氧形成氢键，键长为4.09 Å；FA的羧基氧分别与Arg483、Arg484的氨基氢形成氢键，键长分别为5.32、4.89 Å；FA的羰基氧与Arg484的氨基氢形成氢键，键长为5.12 Å。同时，FA酚羟基上电负性的氧与Trp213吲哚基上的双键碳形成了碳氢键（O···CH2＝CH2），键长为5.18 Å。4 个氢键对维持FA与BSA形成复合物的稳定起关键作用。另外，FA的苯环分别与BSA的疏水性氨基酸Leu197、Leu346、Leu480、Val481的烃基侧链形成了4 个疏水键，键长分别为6.69、6.39、5.05、4.80 Å，其减少了疏水性氨基酸与水的作用，有助于维护FA与BSA形成复合物的三维结构。此外，FA与BSA的Ser201、Val342、Ser343、Arg347、Ser453、Leu456、Asn482、Pro485残基形成了范德华力。

3 结 论

实验利用光谱法和分子对接技术研究了PCA和FA分别与BSA的相互作用。紫外光谱发现，298 K时PCA和FA均会导致BSA的特征吸收峰强度和波长发生改变。荧光光谱的研究表明PCA和FA均会导致BSA的内源荧光发生静态猝灭，λem红移，且PCA对BSA的作用更明显；PCA和FA在BSA上均只有1 个结合位点，且PCA与BSA之间的结合能力强于FA与BSA的结合；由于ΔG、ΔS、ΔH值均小于0，所以PCA和FA主要靠氢键和范德华力与BSA形成稳定复合物，且此过程自发进行。同步荧光光谱的结果说明，PCA和FA的加入均会影响BSA的Tyr残基或Trp残基的微环境，并导致Tyr和Trp的荧光发生猝灭，且Trp的荧光猝灭效率大于Tyr的荧光猝灭效率。分子对接进一步验证了光谱实验的结果，并发现PCA、FA在BSA上的最佳结合位点在IIA、IIIA结合域之间的疏水空腔中，且距离IIA结合域更近，同时因为PCA比FA距离BSA的Trp213更近，其对应关系为0.512 nm＜0.518 nm，由此推测PCA更容易被BSA贮存运输。