植物乳杆菌YW11胞外多糖对酸乳加工特性的影响

蔡 淼，郝晓娜，罗天淇，陈 超，曹永强，杨贞耐,,

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048；2.东君乳业（禹城）有限公司，山东 德州 253000）

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的多糖类化合物[1]。乳酸菌EPS具有多种有益健康的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和降低胆固醇等[2]。同时，这种高分子化合物还具有良好的稳定性、保水性、凝胶性和乳化性[3]。由于乳酸菌EPS具有普遍认可的安全性（generally recognized as safe，GRAS），其在食品工业中作为一种天然的功能性添加剂备受关注。

AI-2在细菌对数生长早期及中晚期升高均未超过0.8，无调节细菌形成生物膜作用，AI-2变化趋势与细菌生长曲线无直接相关性，见图4。

据报道，产EPS乳酸菌应用于发酵乳中，能够提高其黏度和保水能力[4]；产EPS长双歧杆菌YS108R能够降低发酵乳的乳清脱水收缩，提高其持水能力及表观黏度[5]；产EPS肠膜明串球菌能够缩短发酵乳的凝乳时间，提高其持水力，增加胶体收缩敏感性[6]；利用产EPS发酵剂生产发酵乳，能够减少乳清析出，改善产品的质地和组织状态，减少使用甚至不使用其他稳定剂[7]。尽管产EPS乳酸菌在发酵乳制品中的应用研究较广泛，但是有关将乳酸菌所产的EPS提取后再应用于发酵乳制品及其对产品加工特性的影响研究较少。研究发现，从鼠李糖乳杆菌RW-9595M发酵液提取得到的EPS应用于酸乳中，可以降低酸乳的黏弹性模量及应力[8]。提取自保加利亚乳杆菌的EPS应用于酸乳中，可提高酸乳的持水力、黏度、黏聚性及回复性，减少乳清析出，降低硬度[9]。有关植物乳杆菌EPS提取物对酸乳加工特性的影响尚鲜见报道。

前期研究表明，分离自藏灵菇的植物乳杆菌YW11菌株所产的EPS由葡萄糖和半乳糖组成，物质的量比为2.71∶1，分子质量为1.1×105Da，分离纯化后总糖质量分数可达92.35%，具有较高的热稳定性，在脱脂乳中、较低温度下及酸性pH值下均具有较高的黏度，微观结构显示出高度分支的多孔结构[10]。此EPS具有抗肿瘤、抗氧化及免疫调节活性[11]；具有较强的乳化能力[12]。植物乳杆菌YW11发酵乳还具有调节人体肠道菌群、增加肠道菌群丰富度和多样性的作用[13]。本研究利用植物乳杆菌YW11的EPS提取物，将其应用于酸乳加工，分析其对酸乳加工特性的影响，包括EPS对发酵过程菌株生长情况、pH值变化、微流变特性的影响，以及酸乳微观结构、质构和风味特性的变化，旨在为植物乳杆菌EPS在发酵乳制品中的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛奶 北京三元股份有限公司；脱脂乳粉 新西兰恒天然集团；发酵剂YO-MIX 300 LYO 丹尼斯克公司；氢氧化钠、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、D-山梨醇、磷酸钾、柠檬酸铵、无水乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、环丙沙星、溴甲酚紫 北京奥博星生物技术有限公司。

EPS为实验室前期从植物乳杆菌YW11提取分离得到，植物乳杆菌YW11由本实验室保藏[10]。

1.2 仪器与设备

在互联网时代，虽然很多信息已经提高了透明度，但是对于企业的金融财务管理过程来说，系统运行过程中的透明度很低，导致企业运行过程中各系统的融合度下降。但是也可以看到，当前很多企业机密信息被不法分子交易，这是由于企业的互联网系统遭到攻击，是互联网系统存在严重漏洞的体现。

1.3 方法

1.3.1 酸乳的制备

鲜牛乳（蛋白质3.1%、脂肪3.7%）预热至60～75 ℃，40 MPa下均质，95 ℃杀菌5 min，冷却至42 ℃，添加酸乳发酵剂（YO-MIX 300 LYO 0.01%）和EPS，于42 ℃发酵至pH值为4.5，迅速置于冷水中冷却至4 ℃，并置于4 ℃冷藏备用。

EDC均质机 上海依肯机械设备有限公司；BCN-1360B超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；HZQ-Q恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅 日本Sanyo公司；S20型数显pH计 上海仪电科学股份有限公司；Master光学法微流变仪 法国Formulaction公司；iCinac乳品发酵监控仪 法国AMS-alliance公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；7890A-7000气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取进样器美国Supelco公司；CR21III低温冷冻离心机 美国Bio-Rad公司。

对照组只加入发酵剂YO-MIX 300 LYO，实验组（EPS-0.05、EPS-0.15、EPS-0.25）除添加发酵剂外分别添加0.05、0.15、0.25 mg/g的EPS。

1.4.3 生活质量 阴道炎患者在治疗后的生活质量采用SF-36评价，该评价表分为第一类和第二类，其中第一类为生理健康，含生理职能、生理功能、躯体疼痛和总体健康4个方面；第二类为心理健康，含情感职能、精神健康、活力和社会功能4个方面。分值越高，说明患者的生活质量越好。

1.3.2 酸乳指标的测定

对酸乳发酵过程的活菌数、pH值和微流变特性指标进行测定，并在酸乳样品4 ℃冷藏24 h后测定样品的持水力、质构、微观结构及挥发性风味。

1.3.2.1 活菌数的测定

酸乳样品中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌活菌数的测定参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[14]。

1.3.2.2 发酵过程中pH值和pH值变化速率的测定

将样品转移至iCinac乳品发酵监控仪中，42 ℃条件下对发酵过程中pH值的变化进行监测，每1 min记录一次样品pH值和pH值变化速率。

1.3.2.3 微流变特性指标的测定

1.3.2.4 持水力的测定

基于上述单元信息知识组织的流程，建立基于本体和关联数据的单元信息知识组织框架，如图3所示，该框架为4层结构，从下至上分别为数据层、语义聚合层、数据关联层和应用层。各层功能相对独立，上层功能基于底层功能实现。

取接种后的牛乳20 mL至微流变仪专用样品池中，将样品池插入微流变仪，运行测试程序。在42 ℃监测发酵凝胶形成过程中微流变学参数即弹性指数（elasticity index，EI）、宏观黏度指数（microviscosity index，MVI）及流动性指数（fluidity index，FI）随时间的变化情况[15]。每隔1 min记录一次数据。

准确称取15 g酸乳样品置于50 mL的离心管中，5 000 r/min、4 ℃离心15 min。除去上清液，称量剩余沉淀的质量，并按下式计算持水力：

图2显示，整体上各组样品pH值的变化趋势相同，即pH值先下降后趋于稳定。在发酵前期，pH值变化速率处于较低水平，pH值缓慢下降，结合图1可知，此阶段活菌数快速增加，可能是由于此阶段主要进行了菌株自身的生长繁殖，尚未大量产酸；发酵约80 min，pH值变化速率出现短暂的平稳期，之后快速增加，pH值迅速下降，此时菌体进入对数生长期，菌体在进行自身繁殖的同时开始快速产酸；约至120 min，pH值变化速率达到最大，pH值快速下降，随后pH值变化速率快速降低；大约150 min后，pH值变化速率进入缓慢减小阶段，pH值随之由快速降低阶段进入稳定阶段。由图2可知，在整个发酵过程中，EPS-0.05、EPS-0.15、EPS-0.25组均未减缓pH值的下降速率，可见，不同添加量EPS均不会降低菌株的产酸速率。

工作室中的成员本质上属于一个“学习共同体”，“学习共同体”是一种关于学习和学习者的社会性安排，它提供给学习者围绕共同的知识建构目标而进行社会交互的机会，以活动为载体的社会交互中蕴含着多种层次的参与：边缘的和核心的，每一个成员从不同水平和不同角度加入到围绕知识的合作、争论和评价中，并且从中获得来自他人和人工制品的支持，在形成共同体的共识性知识的过程中确立自己的身份感[5]。在学习共同体中，学习者彼此尊重，平等地对话交流，形成密切的关联，在共同活动和频繁的交往中，学习者之间很容易产生情感，相互信任，形成轻松愉快的学习氛围，进而能够产生归属感，更有利于学习活动的开展。

酸乳样品在4 ℃冰箱贮存24 h后，采用Brookfield CT3质构仪进行乳样全质构测定，TA10平底柱形探头，直径2.5 cm，测定速率5.0 mm/s，刺入深度10 mm，返回速率5.0 mm/s。统计第1循环硬度、黏力、内聚性。

1.3.2.6 扫描电镜观察

分别取酸乳样品，加入质量分数2.5%、pH 6.8的戊二醛溶液进行固定。将上述样品置于液氮中冷冻，取出后用刀片切断横截面，并用磷酸盐缓冲液（pH 6.8）冲洗3 次，每次10 min。用乙醇进行梯度（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脱水，每次10 min，其中无水乙醇冲洗3 次，其他体积分数各冲洗1 次。用氯仿脱脂2 h，脱脂的同时间隔振荡，用叔丁醇置换其中的乙醇，经过冷冻干燥后选择要观察的面进行固定。采用离子溅射的方法镀金，使用扫描电镜进行观察[16]。

前者生成的空调系统在设备特征中存在数据理想化的问题，在管路布置中存在偏差。接下来，分别对两者进行修正，并对系统进行图示化处理。

1.3.2.7 挥发性风味物质的测定

气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；载气为氦气，恒定流速为1.2 mL/min；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温到230 ℃，保持0 min，再15 ℃/min升温到260 ℃，保持3 min；进样口温度250 ℃，压力14.87 Pa，分流比10∶1。

面对汽车能源类型与汽车技术的变化，维修技术人员可以通过不断地接触电驱动理论与电驱动维修过程而自然过渡。从原来的化油器车转型到电喷车型，维修技术人员经历的也是自然而然的慢进过程，所以维修技术人员不必担心会发生突如其来的变化，不断学习做好迎新事物的准备即可。

质谱条件：电子电离源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z40～250。

化合物由质谱数据库NIST08、文献报道的保留指数RI值和芳香特性分析鉴定。2-甲基-3-庚酮作为内标物，采用内标法计算挥发性风味物质的含量。

1.4 数据分析

采用许倩倩等[17]方法，使用气相色谱-质谱联用技术测定酸乳样品的挥发性风味物质。首先取5 g酸乳样品，加入到30 mL萃取瓶中，加盖密封，置于40 ℃水浴锅中平衡20 min，固相微萃取吸附30 min后插入气相色谱进样口，250 ℃条件下解吸5 min。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌EPS对酸乳发酵过程发酵剂菌株生长及pH值的影响

在酸乳发酵过程中，随着pH值降低，乳中微粒的状态发生改变，最终形成以酪蛋白胶粒为基础的凝胶结构，其流变特性也发生了显著变化。光学微流变仪通过监测样品中粒子的运动，可在不破坏样品的前提下测定样品流变特性指标[18]。

图1 EPS添加量对酸乳发酵过程中保加利亚乳杆菌（A）和嗜热链球菌（B）活菌数变化的影响Fig.1 Effect of EPS at different concentrations on changes in viable counts of Lactobacillus bulgaricus (A) and Streptococcus thermophilus (B)during the fermentation of yogurt

1.3.2.5 质构指标的测定

图2 EPS添加量对酸乳发酵过程中pH值和pH值变化速率的影响Fig.2 Effect of EPS at different concentrations on pH and pH change rates during the fermentation of yogurt

2.2 植物乳杆菌EPS对酸乳发酵过程微流变特性变化的影响

图1显示，在发酵过程中，各组样品两种发酵剂菌株活菌数均呈上升的趋势，在0～60 min菌体繁殖速度较快，活菌数增加；在60～120 min菌体进入对数生长期，活菌数增长迅速；在120 min后，两种发酵剂菌株活菌数增长速率均较为缓慢，发酵结束时二者均达到较高的活菌数即109CFU/mL左右。相比于对照组，在整个发酵过程中，EPS-0.05、EPS-0.15、EPS-0.25组对两种发酵剂活菌数均未产生显著影响。可见，不同添加量的EPS均不会抑制两种发酵剂菌株的生长。

图3 EPS添加量对酸乳发酵过程中EI（A）、MVI（B）、FI（C）的影响Fig.3 Effect of EPS at different concentrations on EI (A), MVI (B) and FI (C) during the fermentation of yogurt

由图3A可知，在发酵开始至约140 min，各组样品处于低弹性的液体状态，其EI值无明显变化；发酵140 min后，牛乳开始凝胶化，EI几乎垂直快速增加；可见在发酵前期各组样品EI的变化及凝胶点时间基本一致，说明添加EPS对发酵前期牛乳凝胶的形成没有明显影响。一般而言发酵凝乳速率主要受温度和发酵剂菌种的影响[19]。发酵至约175 min各组样品的EI缓慢增加，进入高弹性阶段，初步形成较为稳定的凝胶结构；各组样品EI出现一定差异变化，其中对照组处于最高水平，EPS-0.25组最低，EPS-0.05、EPS-0.15组较为接近，介于对照组和EPS-0.25组之间。因此，不同添加量EPS对酸乳EI的影响主要体现在发酵后期，较高添加量一定程度上降低凝乳弹性。

由图3B所示，发酵前140 min所有样品MVI值较小，此时样品处于低黏度的液体状态，各组样品的MVI较为接近；140 min后牛乳开始凝胶化，约180 min各组样品MVI几乎垂直快速上升，并在约200 min达到最大值；此时酪蛋白胶束发生聚集，相互连接形成三维网状结构，形成较为稳定的凝胶体系[20]。随后，各组样品MVI迅速下降。这可能是由于在发酵过程中pH值持续下降，引起乳清析出，导致发酵乳结构不稳定。与前述EI的变化相似，各组样品MVI在发酵后期出现一定差异变化，所有EPS组样品MVI均高于对照组，并且以EPS-0.15组最大，EPS-0.05、EPS-0.25组的MVI较为接近，介于对照组和EPS-0.15组之间。表明适量添加EPS可以提高酸乳样品的黏稠性。

Z X Liu and M L Jiang contributed equally to this work. All authors commented on the manuscript.

由图3C所示，在凝胶形成前（140 min）各组样品处于液体状态，其FI处于较高值，并有小幅波动，表明此时样品中粒子流动性较强；FI能反映样品中粒子运动的快慢，FI值越大则粒子运动越快，流动性越强[21]。凝胶形成后，各组样品FI几乎垂直快速下降；此阶段样品逐渐由液态向固态转变，至约150 min随着脱水缩合作用的进行，凝胶结构愈加稳定，FI缓慢降低；至约200 min各组样品FI达到最低值，且无明显差异；表明发酵完成后，不同添加量EPS对酸乳产品的流动性影响不大。

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(3)领导职权执行的差异.有的国际化经营企业在领导管理上遵循一系列严格、明确的管理规则，做到职责分明；有的则重视感情的维系和礼仪的规范.因此，不同的职权分配方式形成国际化经营企业的文化冲突.文化冲突影响了跨文化管理者与员工之间的和谐关系，管理者需要用原有文化背景下的死板的规章制度来控制企业以及企业管理的运行，而员工则会消极应付工作，管理陷入困境.

2.3 植物乳杆菌EPS对酸乳质构特性的影响

持水力是评价酸乳品质的重要指标。在酸凝胶体系中，酪蛋白分子聚集形成的网状结构可容纳水分等小分子物质，其结合的水分子越多，乳清析出越少，产品品质越好。如图4所示，EPS实验组即EPS-0.05、EPS-0.15、EPS-0.25酸乳样品的持水力分别为54.50%、56.59%、57.93%，均显著高于对照组（P＜0.05），相比对照组分别提高了6.57%、10.63%、13.28%。可见随着EPS添加量的增加，酸乳体系水分保持能力增强。发酵乳基质中存在的EPS有助于酪蛋白胶束间的相互作用而形成更加稳定的三维网状结构[22]。同时该网络结构中存在的EPS可以限制发酵乳的脱水收缩作用，从而提高发酵乳的稳定性[23]。

图4 EPS添加量对酸乳持水力的影响Fig.4 Effect of EPS at different concentrations on water-holding capacity of yogurt

如表1所示，相比对照组酸乳样品的硬度14.30 g，各EPS组，EPS-0.05、EPS-0.15和EPS-0.25组样品的硬度分别为13.07、11.10 g和10.08 g，比对照组分别降低了8.60%、22.38%和29.51%；可见EPS的添加导致酸乳硬度略有下降，且当EPS添加量较大时（0.15 mg/g及以上），硬度下降显著（P＜0.05）。与硬度的变化相反，添加EPS提高了酸乳样品的黏力，各EPS组，EPS-0.05、EPS-0.15和EPS-0.25组样品的黏力与对照组相比，分别提高13.50%、35.01%和50.24%。但是，添加EPS对酸乳样品的内聚性没有明显影响，各组的内聚性测定值在0.45～0.48之间。Ibrahim[24]的研究发现使用产EPS的菌株作为发酵剂，会导致发酵乳变软的现象。但Yang Tongxiang等[22]研究发现EPS的存在会导致发酵乳硬度增加。这可能与不同菌株EPS的特性不同，及其与乳基质中蛋白质的相互作用不同有关，从而导致酸乳的硬度不同。有关乳酸菌EPS与乳蛋白质的相互作用及其对酸乳硬度的影响有待进一步研究。添加EPS能够改善酸乳的黏力可能与EPS在溶液中的固有黏度有关[25]，而且EPS在酸性溶液（pH 4.6）中的黏度高于中性溶液（pH 7.0）[10]。同时，EPS可能存在于乳蛋白质网络结构聚集体之间的孔隙中，有助于提高酸乳的黏度[26]。

人文主义精神是一种普遍的人类自我关怀，表现为对人的尊严、价值、命运的维护、追求和关切[4]。受市场经济等因素影响，我国医疗卫生事业中部分医务人员道德素质下降，医患关系日益紧张，对医学生自身发展和病人健康造成冲击，医学的人性光芒日趋黯淡，医学的人文主义精神衰落，同样也对整个社会的伦理道德产生严重冲击。为此，加强医学生人文主义教育成为高等医学院校思想政治教育的主要任务，具体内容及实施路径见图1。

表1 EPS添加量对酸乳硬度、黏力和内聚性的影响Table 1 Effect of EPS at different concentrations on hardness, viscous force and cohesiveness of yogurt

2.4 植物乳杆菌EPS对酸乳微观结构的影响

如图5所示，各组酸乳样品均呈现多孔的网状结构，添加EPS会引起酸乳微观结构的显著变化。对照组样品蛋白质网络结构分布比较均匀，且结构连续性好，形成的网孔较小。与对照组相比，EPS-0.05组酸乳样品的网络结构中有少量的大孔隙产生，且网孔分布相对不均匀；EPS-0.15组样品的网络交联程度变得紧密，但连续性有所减弱，结构变得细碎；EPS-0.25组样品的网孔更大，且酪蛋白结构更为细碎。不同样品之间的差异在高倍镜下观察更为明显，可能是由于乳蛋白与EPS之间产生了位阻效应以及相互排斥作用，使得蛋白胶束间的交联结构较强，蛋白间产生少量的大空隙[27]。有研究表明，外源添加的EPS在乳蛋白聚集前已形成了自身的结构，形成了强大的空间位垒和排斥作用，使得蛋白质只能形成细碎不连续的结构，发酵乳的外观呈稀软状[28]。

图5 不同EPS添加量酸乳样品的扫描电镜图Fig.5 Scanning electron micrographs of yogurt samples added with different amounts of EPS

2.5 植物乳杆菌EPS对酸乳风味特性的影响

风味是评估发酵乳品质的主要指标之一[29]。相关研究表明，乳酸菌EPS能够促进发酵乳良好风味的产生，降低乳香物质损失降低，对风味物质起到保护作用[30]。采用固相微萃取-气相色谱-质谱对各组酸乳样品的挥发性风味物质进行分析，结果如表2所示。4 组酸乳样品共检出34 种挥发性风味物质，包括9 种酮类、6 种烃类、6 种醛类、10 种酸类、1 种醇类和2 种酯类化合物。在酸乳中添加EPS，主要能够促进酸乳中醛类、酸类和酯类风味物质的形成。

其次是理解信息。理解信息是在通读全文后，针对某一句话，放入语境中理解语义，这也需要对专业术语有深入了解，需要翻译者有较强的英语思维，跨越文化差异带来的影响，将特定情境下的语义正确的表达出来。

表2 EPS添加量对酸乳挥发性风味物质的影响Table 2 Effect of EPS at different concentrations on volatile flavor substances in yogurt

醛类化合物是发酵乳特征风味的重要贡献成分。EPS-0.05组样品中壬醛和癸醛的含量最高，随EPS添加量的增加其含量逐渐降低；壬醛带有柑橘、鲜花的香气，癸醛有橙皮与牛油气味。辛醛和糠醛仅在对照组及EPS-0.15组样品中检出；辛醛具有果香的风味特征，糠醛有鲜花的香气。此外，所有酸乳样品中均检测到苯甲醛，并且在EPS-0.25组中含量较高，苯甲醛具有坚果香、杏仁香[31]。

挥发性有机酸主要是脂肪酶作用下脂肪水解形成的。酸类物质具有清爽的口感和乳香味，而且还是其他风味物质的前体物质，如通过酶的作用，有机酸可以转化成酮类、酯类等挥发性风味物质[32]。本研究发现，不同添加量的EPS使酸乳中乙酸、丁酸、己酸、辛酸含量有不同程度的增加，其中乙酸在EPS-0.05组中含量最高，丁酸、己酸和辛酸在EPS-0.15组中含量最高。乙酸赋予发酵乳淡淡的酸味；丁酸具有多汁味、奶油味；己酸具有油脂味；辛酸具有清香和微弱的水果酸气味，淡酸味[33]。

所有EPS组样品中均检出了两种酯类，分别为γ-丁内酯及丁位癸内酯，但对照组未检出；γ-丁内酯有奶油气味[34]，丁位癸内酯能够产生类似椰子气味的香气[35]。

主成分分析（图6）结果表明，在EPS添加量较低时（0.05 mg/g），酸乳样品中大多数风味化合物含量较高，尤其是2,3-丁二酮（1）、2-壬酮（6）、壬醛（17）、庚酸（27）、丁位癸内酯（34）等；2,3-丁二酮使发酵乳具有奶油味，是形成发酵乳风味的主要成分[36]。如表2所示，所有EPS组2,3-丁二酮含量较对照组均有不同程度的增加，其中EPS-0.05组含量最高，说明添加适量EPS有利于酸乳良好风味的形成，其作用机制有待进一步研究。

图6 酸乳风味物质的主成分分析Fig.6 Principal component analysis plot for flavor compounds in yogurt with different amounts of EPS added

3 结 论

在酸乳加工过程中，添加植物乳杆菌YW11 EPS对发酵过程中发酵剂菌株的生长和产酸速率没有明显影响，但是EPS能够降低酸乳样品的弹性，增加其黏性，对FI无显著影响。随着EPS添加量增加至0.25 mg/g，酸乳持水力和黏力提高，硬度下降，对酸乳的内聚性影响不大。扫描电镜显示，添加EPS使酸乳中蛋白交联结构增强，蛋白颗粒更小，网络结构中存在较大孔隙结构。固相微萃取-气相色谱-质谱结果显示，添加适量的EPS能够促进酸乳中醛类、酸类和酯类风味物质的形成。因此，植物乳杆菌YW11 EPS应用于发酵乳加工对于改善其质构和风味特性具有良好的应用前景。