自身免疫性甲状腺炎甲状腺组织和外周血单个核细胞中微小RNA-142-3p、微小RNA-150表达及临床意义

2021-07-28王征张浩李伟汉翟晓建宋春峰郭满

安徽医药 2021年8期

王征，张浩，李伟汉，翟晓建，宋春峰，郭满

桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，它是一种自身免疫性疾病，且是引起甲状腺功能减退的病因之一。HT病人的遗传易感性使机体易发生自体免疫反应，与女性卵巢功能异常甚至不孕均存在关联，且HT 与乳头状甲状腺癌的高发病率有明显相关性，因此寻找用于HT 早期诊断的临床指标十分必要。微小RNA（miRNA）是一类非编码小分子单链RNA，进化中高度保守，在许多疾病发生的过程中均有异常表达，是调控细胞增殖、代谢、凋亡等生物活动的关键调节分子。许多miRNA 被证实在炎症性自身免疫疾病过程中发挥抗炎或促炎作用。研究表明miR-142-3p、miR-150 均在类风湿关节炎等慢性自身免疫炎症性疾病中表达异常。但目前同时检测甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 表达水平，同时探讨两者水平变化与HT 病人病情关系的研究较少。

因此，本研究通过检测HT 病人甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 表达水平，探讨二者表达水平在HT 病人中的临床意义，为miR-142-3p、miR-150 在 HT 疾病中应用提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月至2019年6月于南阳市中心医院住院进行甲状腺手术切除并经病理确诊为HT的87例病人为研究对象（HT组），男36例，女51例，年龄（44.26±16.41）岁，年龄范围为27～61岁；均因甲状腺肿出现气管压迫症状或疑诊为甲状腺癌施行手术，术后病理证实为HT；同期选取73 例于南阳市中心医院进行甲状腺腺瘤切除术的非癌病人作为对照（对照组），男29例，女44例，年龄（42.38±17.54）岁，年龄范围为25～60岁。两组之间性别、年龄均差异无统计学意义（

＞0.05），具有可比性。

纳入标准：①均符合 HT 诊断标准；②有甲状腺功能减退的体征；③典型的临床症状，如可触及弥漫性甲状腺肿大且出现气管压迫症状、伴峡部锥体叶肿大、质地较韧等；④病历资料清晰完整者；⑤甲状腺B超回声不均。排除标准：①精神异常者；②伴有肝炎、肾病、糖尿病、结核病等其他内科疾病；③患有慢性炎症性疾病、急性感染性疾病者；④严重的肝肾功能不全者；⑤妊娠或哺乳期妇女。所有研究对象均自愿参加，并签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

1.2 研究方法

1.2.1

样品采集及保存清晨抽取两组空腹外周静脉血样，3 000 r/min 离心15 min 后收集血清，置于-80 ℃保存待测；取甲状腺手术切除后的甲状腺组织标本，对照组取甲状腺腺瘤旁的“正常”甲状腺组织，置于-80 ℃保存待测。

1.2.2

单个核细胞的分离及处理（1）稀释：将采集血样置于离心管中并加入同等体积的PBS液充分混匀；（2）加样：将混匀的血样缓慢、贴壁加入盛有外周血淋巴细胞分离液的离心管中，以细胞分离液同血样明显分层为佳，切忌破坏界面；（3）离心：将样品放入离心机中2 000 r/min 水平离心20 min；可见离心管中出现明显分层。最上层为淡黄色血清，第二层为乳白色淋巴细胞层，第三层为分离液层，最下层为红细胞层。第二层中的白色薄层即为外周血单个核细胞层；（4）样品收集：收集第二层到EP管，2 000 r/min 低温离心5 min。弃上清，收集乳白色细胞；（5）PBS 冲洗：加入大约 5 倍体积的 PBS 缓冲液，吹悬数次，1 000 r/min 低温离心10 min，弃上清，重复2～3次，-80 ℃保存备用。

1.2.3

qRT-PCR 法检测甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 水平采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测两组甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 水平。采用 RNA 提取试剂盒提取甲状腺组织和外周血单个核细胞总RNA，反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用qRT-PCR 仪对miR-142-3p、miR-150 进行扩增，qRT-PCR 反应体系共 10 μL：miScript SYBRGreen Mix 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，ddHO 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。miR-142-3p 反应条件：95 ℃，90 s；95 ℃、10 s，60℃、30s，40 个循环。miR-150 反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃、15 s，58 ℃、60 s，40 个循环。miR-142-3p、miR-150 及内参 U6 的引物序列见表 1。采用 2法对血清 miR-142-3p、miR-150表达水平进行定量分析。

表1 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物序列

1.2.4

检测甲状腺功能参数和相关细胞因子水平采用电化学发光法检测游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游离甲状腺素（Free Thyroxine，FT4）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）水平。采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测细胞因子白细胞介素17（interleukin 17，IL-17）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的水平。操作方法严格按试剂盒及仪器使用说明书进行。

1.3 主要试剂与仪器

人外周血淋巴细胞分离液（货号P8900），购自北京索来宝公司；RNA 提取试剂盒（货号：DP419），购自于北京天根生化有限公司；miScript SYBRGreen qPCR Kit（货号218073），购自德国 QIAGEN 公司。CFX96 型 qRT-PCR 仪，购自美国Bio-Rad 公司；E170型电化学发光免疫分析仪，购自瑞士Roche公司。

2 结果

2.1 两组一般资料及甲状腺功能参数比较

两组年龄、性别、体质量指数（BMI）比较，均差异无统计学意义（

P＞

0.05）。两组甲状腺功能参数比较，均差异有统计学意义，HT 组TSH、TPOAb 水平显著高于对照组（

＜0.05），FT、FT水平显著低于对照组（

＜0.05）。见表2。

表2 两组一般资料及甲状腺功能参数比较

2.2 两组甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR

142

3p、miR

150 水平比较

HT 组甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 表达水平均显著高于对照组（

＜0.05）。见表3。

表3 两组甲状腺组织和外周血单个核细胞中微小RNA-142-3p（miR-142-3p）、微小 RNA-150（miR-150）水平比较/

2.3 两组相关细胞因子水平比较

两组相关细胞因子水平比较，均差异有统计学意义，HT 组IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1水平显著高于对照组（

＜0.05）。见表4。

表4 两组相关细胞因子水平比较（/ng/L，）

2.4 HT 病人甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR

142

3p、miR

150 水平相关性

Pearson 法分析结果显示，HT病人甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 水平均呈正相关（

=0.605、0.632，均

＜0.05）。见图1，2。

图1 HT病人甲状腺组织中miR-142-3p、miR-150水平相关性

图2 HT病人外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150水平相关性

2.5 HF 病人

miR

142

3p、miR

150 水平与甲状腺功能参数及相关细胞因子相关性

HF 病人甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150水平与 FT、FT均呈负相关（

＜0.05），与 TSH、TPOAb、IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1 均呈正相关（

＜0.05）。见表5。

表5 HT病人miR-142-3p、miR-150 水平与甲状腺功能参数及相关细胞因子相关性

3 讨论

HT是最常见的自身免疫性甲状腺疾病，也是一种器官特异性疾病。HT 病人可能出现典型的甲状腺功能亢进或低下，主要表现为：手抖、心悸、易便秘、女性月经不规律等。HT 可能会进一步引发乳头状甲状腺癌等疾病，对病人身心健康造成威胁，使其生活质量下降，医疗费用增多，不良结局发生率升高。HT 发病因素具有多样性且早期发病症状不十分明显，因此寻找早期评价HT 的指标对于降低患病率具有重要意义。

miRNA 在细胞凋亡、生物发育等过程中发挥重要的调控作用，且有研究表明，miRNA 水平的异常变化与炎症性免疫疾病、肿瘤等的发生、发展有关，如类风湿性关节炎、代谢综合征、炎症性肠病等。因此，miRNA 在炎症性免疫疾病中的检测和鉴定也迅速发展为热门研究领域。而HT 作为第一个器官特异性自身免疫性疾病，至今较少有文献报道其相关miRNA 表达水平情况。对miR-142-3p、miR-150目前的研究主要集中在癌症方面，关于自身免疫性疾病的研究较少，然而有研究报道其在自身免疫性疾病中表达显著升高，且与疾病严重程度相关，提示miR-142-3p、miR-150 可能在免疫性疾病中发挥重要作用。张顺霞等采用miRNA芯片技术对HT 和正常甲状腺组织中miRNA 的表达进行比较，发现与正常甲状腺相比，HT 中miR-142-3p、miR-150 等基因表达上调，miR-654-5p、miR-610 等基因表达下调。本研究结果表明，HT组甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 表达水平均显著高于对照组，且均呈正相关。提示HT 病人中miR-142-3p、miR-150 表达水平高于正常人群，二者可能与HT 疾病发生有密切联系，临床上可将其作为早期诊断HT 的参考指标密切监测其水平变化，对降低患病率可能有重要作用。进一步研究发现两组甲状腺功能参数比较，均差异有统计学意义，HT 组 TSH、TPOAb 水平显著高于对照组，FT、FT水平显著低于对照组；两组相关细胞因子水平比较，均差异有统计学意义，HT 组IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1 水平显著高于对照组。已有研究表明，FT、TSH 及 IL-17、IL-6 等参数是 HT 诊治过程中的常用手段，也是表征甲状腺功能的重要指标。因此本研究中各指标水平异常变化反映了HT 病人中甲状腺功能可能受损。HF 病人甲状腺组织和外周血单个核细胞中 miR-142-3p、miR-150 水平与FT、FT均呈负相关，与 TSH、TPOAb、IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1 均呈正相关。提示 miR-142-3p、miR-150 水平的升高可能与机体甲状腺功能受损，继而导致的炎症反应有关，表明miR-142-3p、miR-150 可能参与HT疾病的发生、发展。

综上所述，HT病人甲状腺组织和外周血单个核细胞中miR-142-3p、miR-150 呈高表达。猜测miR-142-3p、miR-150 水平升高可能是由于机体甲状腺功能受损，进而导致机体的炎症免疫反应加速HT病情的发生、发展，二者联合使用对早期HT 诊断有一定临床参考价值。但机体甲状腺功能受损以及由此引发的炎症反应具体如何影响miR-142-3p、miR-150 水平尚需进行下一步探讨，且本研究中样本数量较小，范围局限，需加大样本量进一步研究。