长链非编码RNA膀胱癌相关转录物1对微小RNA-503-5p的靶向关系及对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响
2021-07-28黄荣樊明湖黄芬卢小菊李新建
黄荣，樊明湖，黄芬，卢小菊，李新建
结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在癌症中排名第三，但死亡率排名第二。在结直肠癌的发生和进展中，多个种系和体细胞突变不断积累，特别是一些关键的致癌基因和肿瘤抑制基因。随着对结直肠癌发病机制认识的深入，分子靶向药物和免疫疗法等新的治疗策略被开发出来，极大改善了结直肠癌患者的预后。然而，结直肠癌肿瘤发生的分子机制复杂，涉及许多过程。因此，进一步揭示其潜在的分子机制，开发更有效的治疗干预措施有助于提高患者预后。越来越多的证据表明，遗传和表观遗传失调在肿瘤的产生发展中起着至关重要的作用。日前，非编码RNA 的生物学功能被广泛研究，包括微RNA（microRNA，miRNA/miR）和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。膀胱癌相关转录物1（bladder cancer associated transcript 1，BLACAT1）在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤中表达上调，能促进癌细胞的增殖和转移，而BLACAT1的下调抑制癌细胞的体外增殖、侵袭和移植瘤的体内生长。miR-503-5p 可以抑制膀胱癌细胞的增殖，并调控卵巢癌细胞的增殖、凋亡、转移或耐药。然而 BLACAT1 和 miR-503-5p 在结直肠癌中的生物学功能仍不清楚。本研究自2019年1-10 月考察BLACAT1 在结直肠癌细胞中的表达，及对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响，并结合miR-503-5p，探讨结直肠癌潜在的分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460 和结肠癌细胞株SW620，LOVO，HT29 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，RPMI-1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute）购自美国Gibco公司，胎牛血清、青霉素-链霉素购自美国Hyclone公司，PrimeScript™RT试剂盒购自大连Takara公司，RIPA裂解缓冲液、噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma 公司，si-con、si- BLACAT1、miR-con、miR-503-5p、anti-miR-con、anti-miR-503-5p 购自上海 GenePharma公司，β 肌动蛋白（β-actin）、细胞核相关抗原67（Ki-67）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、活化的多聚ADP-核糖聚合酶（Cleaved PARP）和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved caspase-3）抗体购自美国Cellular Signaling Technology 公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自英国Abcam 公司，双重荧光素酶报告基因测定系统购自美国Promega公司。1.2 细胞培养
NCM460、SW620、LOVO和HT29细胞在RPMI-1640 培养基中培养，所有培养基均补充10%的胎牛血清、1%青霉素-链霉素，于37℃、5%二氧化碳的湿润环境中生长。1.3 实时荧光定量PCR（qRT
-PCR）检测结直肠癌细 胞 中
BLACAT1 和
miR
-503
-5p 表 达
利 用TRIzol 试剂从 NCM460、SW620、LOVO 和 HT29 细胞提取总RNA。使用PrimeScript™RT试剂盒将提取的RNA 反转录为 cDNA，并通过 ABI 7500 定量 PCR 进行扩增。用2法计算相对基因表达，选择GAPDH 和 U6 作 为 内 参 。 引 物 序 列 ：BLACAT1 5-CAAGAGGAGCCGGCTTAGCATCTA-3（正 向），5-ACGGTTCCAGTCCTCAGTCAG-3（反 向）。 内 参GAPDH 5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3（正向），5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3（反 向）。 miR-503-5p 5-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3（正向），5-GTAATACGGTTATCCACGCG-3（反向）。内参U6 5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3（正向），5-GGAACGCTTCACGAATTTG-3（反向）。1.4 细胞转染
将HT29 细胞接种于6 孔板中（每孔2×10个细胞），待细胞融合至80%左右时，利用Lipofectamine 2000 试 剂 ，将 si-con、si- BLACAT1、pcDNA、pcDNA-BLACAT1、miR-con、miR-503-5p、anti-miR-con、anti-miR-503-5p 转染到 HT29 细胞，培养48 h 后，收集细胞，依照1.3 所述方法检测BLACAT1和miR-503-5p表达，并进行后续指标检测。1.5 MTT 检测结直肠癌细胞增殖
将HT29 细胞接种于 96 孔板，培养 48 h 后，加入 20 μL 的 MTT 溶液，培养4 h 后加入150 μL 二甲基亚砜，剧烈震荡10 min，读取酶标仪490 nm 波长处的吸光度（OD）值，计算细胞存活率（%）。胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。1.6 流式细胞术检测结直肠癌细胞凋亡
根据异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒说明书的步骤，将HT29 细胞密度调整为 1×10个/毫升，加入 5 μL 的Annexin V-FITC和5 μL的PI染色液，分别混匀，黑暗反应15 min，于流式细胞仪检测HT29细胞的凋亡。1.7 蛋白质印迹法（Western blotting）检测结直肠癌细胞Ki
-67、CyclinD1、Cleaved PARP 和
Cleaved caspase
-3 的表达
用RIPA 裂解缓冲液提取细胞总蛋白。将样品在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）凝胶中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。随后在4 ℃条件下与Ki-67、CyclinD1、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 和内参照β-actin 的一抗（稀释比为1∶1 000）孵育过夜。第二天，将膜与二抗（稀释比为1∶2 000）在室温孵育1 h。使用ECL检测系统检测目的蛋白的信号。1.8 靶基因预测和双荧光素酶报告实验
starbase预测BLACAT1 的靶基因，发现BLACAT1 与miR-503-5p存在互补配对位点。构建包含miR-503-5p结合位点的野生型BLACAT1（WT-BLACAT1）和突变型BLACAT1（MUT-BLACAT1）的 pmirGLO 荧光素酶基因报告质粒，利用Lipofectamine 2000试剂，将其与miR-con、miR-503-5p共转染，48 h后参照双荧光素酶检测试剂盒说明书的步骤，进行荧光素酶活性测定。
2 结果
2.1 BLACAT1 和miR
-503
-5p 在结直肠癌细胞和人正常结肠黏膜上皮细胞中的表达
qRT-PCR 检测数据表明，与人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460比较，结肠癌细胞 SW620、LOVO 和 HT29 中 BLACAT1 表达量明显增加，miR-503-5p 表达量减少（P
＜0.05），见表1。选择差异最的HT29细胞用于后续实验。相关性分析结果表明，结直肠癌细胞中BLACAT1和miR-503-5p表达呈负相关，r
=0.3114。
表1 结直肠癌细胞和人正常结肠黏膜上皮细胞中BLACAT1和miR-503-5p的表达/
2.2 沉默或过表达BLACAT1 抑制结直肠癌细胞增殖和诱导结直肠癌细胞凋亡
与si-con 组比较，沉默 BLACAT1 明显减少 HT29 细胞中 BLACAT1 表达量、Ki-67、CyclinD1 蛋白表达量和细胞存活率，增加Cleaved PARP、Cleaved caspase-3蛋白表达量和细胞凋亡率（P
＜0.05）。与pcDNA组比较，过表达BLACAT1 明显提高 HT29 细胞中 BLACAT1 表达量、Ki-67、CyclinD1 蛋白表达量和细胞存活率，降低Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 蛋白表达量和细胞凋亡率（P
＜0.05），见表2。
表2 沉默BLACAT1对结直肠癌细胞增殖和诱导结直肠癌细胞凋亡的影响/（，n=3）
BLACAT1 为膀胱癌相关转录物 1，Cyclin D1 为细胞周期蛋白D1，Cleaved PARP 为活化的多聚ADP-核糖聚合酶，Cleaved caspase-3 为活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3。
2.3 BLACAT1 靶 向
miR
-503
-5p 调 控 其 表 达
starbase 预测到BLACAT1与miR-503-5p部分碱基可形成互补配对现象（图1）。相比于miR-con 和WTBLACAT1共转染，miR-503-5p和WT-BLACAT1共转染明显降低细胞的荧光素酶活性相对活性（P
＜0.05），miR-con、miR-503-5p 和 MUT-BLACAT1 共转染对荧光素酶活性相对活性无影响（表3）。qRTPCR 检测结果发现，转染si-BLACAT1 较转染si-con明显增加miR-503-5p 表达量；转染pcDNA-BLACAT1 比转染 pcDNA 减少 miR-503-5p 表达量（P
＜0.05），见表4。
表3 miR-con、miR-503-5p和BLACAT1共转染对荧光素酶活性相对活性的影响/
表4 BLACAT1 调控miR-503-5p的表达/
图1 BLACAT1与miR-503-5p存在互补配对位点
2.4 miR
-503
-5p 抑制结直肠癌细胞增殖和诱导结直肠癌细胞凋亡
与miR-con 组比较，转染miR-503-5p 明显提高HT29 细胞的miR-503-5p 表达量、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 蛋白表达量和细胞凋亡率，降低 Ki-67、CyclinD1 和细胞存活率（P
＜0.05），见表5。
表5 转染miR-503-5p对结直肠癌细胞增殖和诱导结直肠癌细胞凋亡的影响/（，n=3）
2.5 干扰miR
-503
-5p 部分逆转沉默BLACAT1 抑制结直肠癌细胞增殖和诱导结直肠癌细胞凋亡的作用
与si-BLACAT1 和anti-miR-con 共转染比较，si- BLACAT1 和anti-miR-503-5p 共转染明显减少HT29 细 胞 的 miR-503-5p 表 达 量 、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 蛋白表达量和细胞凋亡率，增加Ki-67、CyclinD1 蛋白表达量和细胞存活率（P
＜0.05），见表6。
表6 干扰miR-503-5p对沉默BLACAT1诱导的结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响/（，n=3）
3 讨论
在结直肠癌肿瘤发生和发展过程中，细胞存活与凋亡至关重要。最近，已经鉴定出许多非编码转录本，这些非编码转录本多数与癌症机制联系紧密，为癌症的诊断和治疗提供了新的机会。这项研究探讨了lncRNA BLACAT1在结直肠癌的表达和作用，BLACAT1可能是结直肠癌的潜在预后生物标志物和治疗靶标。
lncRNA 长度超过200 个核苷酸，参与了肿瘤发生和发展的各个阶段，包括肿瘤的发生、增殖、凋亡和癌细胞的迁移、血管生成、肿瘤的侵袭和转移形成，可作为结直肠癌等癌症的有潜力的诊断和预后生物标志物。既往研究表明，BLACAT1 在肝癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌等多种癌症中的表达异常上调，可用作诊断癌症的非特异性生物标志物，并且可以作为预测子宫内膜癌预后的潜在生物标志物。BLACAT1 在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达上调，并通过海绵miR-144 促进非小细胞肺癌的增殖，迁移和侵袭，其下调抑制了癌细胞进展，迁移、侵袭和上皮-间充质转化。BLACAT1 在胶质瘤、宫颈癌的组织和细胞系中均高表达，BLACAT1 在体外可促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化，敲除 BLACAT1 则抑制了宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。这些结果提示了BLACAT1 在癌症中的致癌潜能。本研究观察到，与人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460 比较，结直肠癌细胞 SW620、LOVO 和 HT29 中 BLACAT1 表达量明显增加。功能实验结果显示，沉默BLACAT1明显减少HT29 细胞的细胞存活率、Ki-67、CyclinD1 蛋白表达量，提高细胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase-3 蛋白水平，过表达BLACAT1 与之相反。表明与前述报道相同，结直肠癌的BLACAT1表达明显上调，沉默BLACAT1 可以抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡，显现出一定的抗癌活性。
miRNA 是另一个类重要的非编码RNA，长度为21-25 个核苷酸。miRNA 通过与互补位点的mRNA结合，诱导靶mRNA 降解和/或翻译抑制，调节基因的表达。miRNA 总是在肿瘤发生和恶性转化中异常调节，与lncRNA 一起成为癌症发病机制的一部分。就结直肠癌细胞而言，已证实某些改变的miRNA 可控制增殖，转移，凋亡。在 miRNA 中，miR-503-5p 在癌症中表达异常。例如，miR-503-5p在肝细胞癌中表达下调，其高表达抑制了肝细胞癌HCCLM3 细胞的细胞迁移，而miR-503-5p 低表达促进了 HCCLM3 细胞的迁移和侵袭。但 miR-503-5p 在结直肠癌细胞增殖和凋亡中的作用尚未可知。本实验中，结直肠癌细胞SW620、LOVO 和HT29 中miR-503-5p 表达量减少，与 Jiang 等的报道一致。另外，转染miR-503-5p 明显减少HT29 细胞的细胞存活率、Ki-67、CyclinD1 蛋白表达量，提高细胞凋亡率、Cleaved PARP 和 Cleaved caspase-3 蛋白水平，说明miR-503-5p 具有一定的抗结直肠癌的功能，可以抑制结直肠癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，与李小辉等的研究相符。
lncRNA 的作用机制复杂。lncRNA 可以与DNA，蛋白质，mRNA 或 miRNA 发生物理结合，并改变结合者的表达，定位和功能。在各种作用机制中，与lncRNA 的miRNA 竞争性结合的报道越来越多。通过竞争性结合常见的 miRNA，lncRNA 减轻了miRNA 引起的靶向mRNA 的降解和/或翻译抑制。如 BLACAT1 通过海绵 miR-361 调节 ABCB1来促进胃癌的奥沙利铂耐药性。本研究检测到结直肠癌细胞中BLACAT1 和miR-503-5p 表达呈负相关。进一步探索BLACAT1 影响结直肠癌细胞增殖和凋亡的机制，生物信息学预测与双荧光素酶报告实验显示，BLACAT1 靶向miR-503-5p。上调或下调BLACAT1 明显调控miR-503-5p 的表达，提示BLACAT1具有负向miR-503-5p表达的作用。此外，干扰miR-503-5p 部分逆转沉默BLACAT1 抑制结直肠癌细胞增殖、Ki-67、CyclinD1 蛋白表达和诱导结直肠癌细胞凋亡、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3蛋白表达的作用。这些结果表明，BLACAT1可能是通过靶向调控miR-503-5p 的表达，从而影响结直肠癌细胞的增殖和凋亡过程。
综上所述，lncRNA BLACAT1 在结直肠癌中表达上调，miR-503-5p 表达下调，沉默 BLACAT1 可以抑制结直肠癌细胞的增殖，和促进细胞凋亡，沉默BLACAT1 发挥抗肿瘤作用的机制与靶向调控miR-503-5p 的表达密切相关，为结直肠癌的临床诊断和治疗提供了有前景的靶点。
