长链非编码前列腺癌相关转录因子6靶向微小RNA-139-3p对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

张来鑫，谢大伟，李青松，邢家辉，钱伟萍

骨肉瘤是一种原发性骨骼恶性肿瘤，常见于儿童、青少年和老年人，约占所有骨骼恶性肿瘤的15%。其多发于四肢管状骨，导致关节活动受限、骨折，甚至发生肺部转移，发病率高，预后较差。近年来尽管手术和术后辅助化疗在一定程度上提高了骨肉瘤病人生存率，但复发或转移性骨肉瘤病人的5 年生存率仅为30%。因此，探索新的治疗靶点对骨肉瘤病人的治疗至关重要。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200 nt 转录本RNA，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中起着重要的调控作用。研究显示lncRNA 前列腺癌相关转录因子6（prostate cancer associated transcript 6，PCAT6）在结肠癌组织中上调表达，促进结直肠癌细胞的生长，抑制细胞凋亡。lncRNA PCAT6 在肺癌中也呈高表达，下调PCAT6 能够诱导肺癌细胞早期凋亡，抑制其增殖和转移。然而，其在骨肉瘤中的作用尚未被研究。生物信息学分析显示，PCAT6 可能与miR-139-3p 之间存在相互作用。miR-139-3p 已被证实可在骨肉瘤中具有增殖抑制和凋亡诱导作用。于是推测PCAT6可能靶向miR-139-3p 参与骨肉瘤进展。因此，本研究拟通过检测骨肉瘤组织以及瘤旁组织中PCAT6 和miR-139-3p 的表达水平，旨在揭示PCAT6 调控miR-139-3p对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取 2016 年 1 月至 2018 年 1 月秦皇岛市中医医院收治的骨肉瘤病人20 例为研究对象。其中男性14例，女性6例，年龄25岁，年龄范围为10～55 岁。选取活检得到的肿瘤组织及癌旁组织，肿瘤标本经病理诊断均为骨肉瘤，癌旁组织为正常组织。纳入标准：病人术前均未接受放疗、化疗或其他治疗；于我院拟采取新辅助化疗后手术治疗。入组病人均同意使用组织样本，且签订知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

骨肉瘤细胞SAOS2 购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所；含有青链霉素双抗的DMEM 培养液购于美国Hyclone 公司；脂质体Lipofectamine2000 购于美国 Invitrogen 公司；PCAT6 小干扰 RNA（si-PCAT6）、小干扰 RNA 阴性对照（si-NC）、抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-139-3p模拟物（miR-139-3p mimics）、模拟物阴性对照（miRNC）、空载体质粒（pcDNA）、miR-139-3p 抑制物（anti-miR-139-3p）、PCAT6 过 表 达 载 体（pcDNAPCAT6）、含miR-139-3p 结合位点的野生型PCAT6荧光素酶报告基因载体（WT-PCAT6）、突变型荧光素酶报告基因载体（MUT-PCAT6）购自上海吉玛制药公司；实时荧光定量PCR 试剂盒（Real-time fluorescent quantitative PCR kit，RT-qPCR）试剂盒购于大连TAKARA 公司；RIPA 裂解液购于北京索莱宝公司；细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）试剂盒购于美国MCE 公司；兔源磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、P21、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukaemia -2，Bcl-2）、细胞周期素 D1（Cyclin D1）以及 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax）抗体购于美国 Abcam 公司；山羊抗兔Ⅱ抗购于南京金斯瑞生物科技有限公司；膜联蛋白异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染细胞凋亡检测试剂盒购于杭州贝博生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1

细胞培养和实验分组 SAOS2 细胞采用DMEM 培养基在37 ℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。每2 d换液1次，待细胞贴壁达到80%时，采用胰酶消化传代。收集5×10个生长状态良好的第 3～5 代对数期 SAOS2 细胞接种 96 孔板，参照Lipofectamine2000 试剂盒步骤进行瞬时转染。将si-PCAT6、si-NC、miR-139-3p mimics、miR-NC 分别转染至60%融合的SAOS2 细胞，并标记为si-PCAT6组、si-NC 组、miR-139-3p 组、miR-NC 组。转染 6 h 后更换新鲜细胞培养液，转染48 h 收集各组细胞，检测lncRNA PCAT6 和miR-139-3p 的表达、以及细胞的增殖活力及凋亡情况。为验证lncRNA PCAT6 是通过调控miR-139-3p 表达进而影响SAOS2 细胞的增殖和凋亡，将si-PCAT6 分别与anti-miR-NC、antimiR-139-3p 共转染至SAOS2 细胞，并标记为si-PCAT6+anti-miR-NC 组 、si-PCAT6+anti-miR-139-3p组，转染48 h检测细胞活力和凋亡情况。

1.2.2

RT-qPCR 检 测 lncRNA PCAT6 和 miR-139-3p 的表达 以TRIzol 法分别提取骨肉瘤组织和各组SAOS2细胞的总RNA 后，参照逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA，参照RT-qPCR 试剂盒说明书以cDNA 为模板进行PCR 扩增。其中PCR 引物由上海生工公司合成。序列如下（5’-3’）：PCAT6正向引物CAGGAACCCCCTCCTTACTC， 反 向 引 物CTAGGGATGTGTCCGAAGGA；GAPDH 正 向 引 物GGGAGCCAAAAGGGTCAT， 反 向 引 物GAGTCCTTCCACGATACCAA。miR-139-3p 上游引物 pGGAGACGCGGCCCTGTTGGAGT；U6 正向引物上游引物ACGCAAATTCGTGAAGCGTT；miR-139-3p 和U6 反向引物为试剂盒提供的通用引物。采用2法 检 测 骨 肉 瘤 组 织 和 各 组 SAOS2 细 胞 中 lncRNA PCAT6和miR-139-3p的表达水平。

1.2.3

CCK-8试剂盒检测细胞活力 将5×10cells/孔接种到 96 孔板，分别在转染 24、48、72 h 取10 μL的CCK-8试剂加到96孔板各孔细胞中，缓慢晃动培养板，混匀后继续孵育2 h，在450 nm 处检测各孔的吸光度值。

1.2.4

流式细胞术检测细胞凋亡 用1×结合缓冲液调整转染48 h细胞浓度为1×10cells/mL。分别取5 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI 加入 100 μL 细胞悬液中，避光条件下孵育15 min，1 h 内上机检测各组SAOS2细胞凋亡情况。

1.2.5

蛋白质印迹法（Western blotting）检测Cyclin D1、Bcl-2、P21 和 Bax 蛋白的表达 利用 RIPA 裂解液提取各组SAOS2细胞总蛋白。蛋白定量后，将2×蛋白上样缓冲液以1：1比例与蛋白样品混合，100 ℃孵育5 min 变性细胞蛋白，配制分离胶和浓缩胶后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后湿法转移蛋白到硝酸纤维素膜。用5%脱脂牛奶在25℃封闭膜1 h，TBST 洗膜 2 min，加入Ⅰ抗室温孵育 2 h，TBST 洗膜10 min，洗涤 3 次，加入Ⅱ抗在25 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗涤3 次后，用化学发光试剂于暗盒内显色，应用ImageJ 软件测定各组SAOS2 细胞目的蛋白灰度值。GAPDH作为内参。

1.2.6

双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA PCAT6 和miR-139-3p 的靶向关系 采用生物信息学分析工具LncBase Predicted v.2 进行靶基因预测显示，lncRNA PCAT6 和 miR-139-3p 之间存在部分特异性结合位点，推测lncRNA PCAT6 和miR-139-3p 存在相互作用。将WT-PCAT6 与miR-139-3p mimics、WT-PCAT6 与 miR-NC、MUT-PCAT6 与 miR-139-3p mimics、MUT-PCAT6 与 miR-NC 分别共转染SAOS2 细胞，转染48 h 时检测各组SAOS2 细胞的荧光素酶活性。为验证lncRNA PCAT6 对miR-139-3p的调控作用，分别将pcDNA、pcDNA-PCAT6、si-NC、si-PCAT6 转染 SAOS2 细胞，转染 48 h，参照上述 RT-qPCR方法检测各组细胞miR-139-3p的表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 进行统计学分析。每组实验均设置3 个复孔或平行实验并重复3次，实验数据以¯x±s表示。两组间比较行独立样本

t

检验，多组间比较行单因素方差分析和SNK-q检验。

P

＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织中lncRNA PCAT6 和miR

-

139

-

3p的表达

骨肉瘤组织中PCAT6 表达水平显著高于癌旁组织，miR-139-3p 表达水平显著低于癌旁组织（

P

＜0.05）。见表1。

表1 骨肉瘤组织中长链非编码RNA（LncRNA）前列腺癌相关转录因子6（PCAT6）和微小RNA-139-3p（miR-139-3p）的表达/

2.2 抑制lncRNA PCAT6 表达对骨肉瘤SAOS2 细胞增殖和凋亡的影响

转染si-PCAT6 后SAOS2 细胞 PCAT6 表达、CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表达、细胞活力（48、72 h）显著降低，p21 蛋白表达、细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高（

P

＜0.05）。见表2。

表2 抑制长链非编码RNA（LncRNA）前列腺癌相关转录因子6（PCAT6）表达对骨肉瘤SAOS2细胞增殖和凋亡的影响/（，n=9）

2.3 lncRNA PCAT6 靶

向 调 控

miR

-

139

-

3p 的

表达

采用生物信息学分析工具LncBase Predicted v.2 进行靶基因预测显示PCAT6 和miR-139-3p 之间存在互补序列，见图1。双荧光素酶报告实验显示，同与 WT-PCAT6 共转染，转染 miR-139-3p mimics 与转染miR-NC 比较SAOS2 细胞荧光素酶活性显著降低（

P

＜0.05），见表 3。RT-qPCR 检测显示，过表达PCAT6 后 SAOS2 细胞 miR-139-3p 的表达水平显著降低；抑制PCAT6后SAOS2细胞miR-139-3p的表达水平显著升高，见表4。

表3 双荧光素酶报告实验/（，n=9）

表4 长链非编码RNA（LncRNA）前列腺癌相关转录因子6（PCAT6）调控miR-139-3p/（，n=9）

图1 前列腺癌相关转录因子6（PCAT6）和miR-139-3p预测结合位点

2.4 miR

-

139

-

3p 过表达对骨肉瘤SAOS2 细胞增殖和凋亡的影响

转染miR-139-3p mimics 后SAOS2细胞 miR-139-3p 表达、p21 和 Bax 蛋白表达、细胞凋亡率显著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达、细胞活力（48、72 h）显著降低（

P

＜0.05）。见表5。

表5 miR-139-3p过表达对骨肉瘤SAOS2细胞增殖和凋亡的影响/（，n=9）

2.5 抑制miR

-

139

-

3p 减弱了抑制lncRNA PCAT6对骨肉瘤SAOS2 细胞增殖和凋亡的作用

与si-PCAT6 组比较，si-PCAT6 组 SAOS2 细胞 miR-139-3p表达、p21 和Bax 蛋白表达、细胞凋亡率显著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达、细胞活力（48、72 h）显著降低；与si-PCAT6+anti-miR-NC 组比较，si-PCAT6+anti-miR-139-3p 组 SAOS2 细 胞 miR-139-3p表达、p21 和Bax 蛋白表达、细胞凋亡率显著降低，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达、细胞活力（48、72 h）显著升高，凋亡率显著降低（

P

＜0.05）。见表6。

表6 抑制miR-139-3p减弱了抑制lncRNA PCAT6对骨肉瘤SAOS2细胞增殖和凋亡的作用/（，n=9）

3 讨论

lncRNA 广泛参与细胞生长、分化和代谢等生物学过程，与骨肉瘤等多种疾病的进展关系密切。本研究旨在揭示lncRNA PCAT6 在骨肉瘤进展中的作用。

肿瘤中异常表达的lncRNA 在调节肿瘤细胞恶性生物表型中发挥重要作用。研究发现lncRNA PCAT6 在卵巢癌组织中表达上调，与远处转移或淋巴结转移密切相关，干扰PCAT6 表达后卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低。胃癌中lncRNA PCAT6 高表达与胃癌病人预后、胃癌转移、临床病理分期呈负相关，过表达PCAT6 增加了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而减少了胃癌细胞的凋亡。此外，lncRNA PCAT6 高表达与宫颈浸润深度及淋巴结转移呈正相关，与总生存期和无病生存期呈负相关，lncRNA PCAT6 高表达是宫颈癌病人不良预后的生物标志物。本研究发现lncRNA PCAT6 在骨肉瘤组织中表达较低，提示lncRNA PCAT6 可能在骨肉瘤的进展中发挥重要作用。进一步研究显示抑制PCAT6 表达可下调骨肉瘤细胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表达，降低细胞活力，上调p21和Bax 蛋白表达，诱导细胞凋亡。提示lncRNA PCAT6在骨肉瘤进展中发挥癌基因作用。

研究表明lncRNA 具有miRNA 分子海绵吸附作用，从而参与对多种肿瘤进展的调控。例如lncRNA PCAT6通过调控miR-330-5p促进了胆管癌细胞的增殖和侵袭。lncRNA PCAT6 还可通过与miR-204 相互作用调节结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。为揭示lncRNA PCAT6 在骨肉瘤中的作用机制，利用在线生物信息学分析工具发现miR-139-3p 和PCAT6 之间存在部分连续结合位点。研究发现miR-139-3p 表达水平与骨肉瘤组织中PCAT6 表达呈负相关，并证实miR-139-3p 是lncRNA PCAT6 的靶基因，且 miR-139-3p 的表达受到lncRNA PCAT6 负性调控。研究报道miR-139-3p 过表达可抑制胶质母细胞瘤细胞的生长和转移。此外，miR-139-3p 在乳腺癌和结肠癌中也发挥抑癌基因作用，miR-139-3p 表达下降与乳腺癌和结肠病人预后较差显著相关，是乳腺癌和结肠病人潜在预后标志物。本研究发现过表达miR-139-3p 可下调骨肉瘤细胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达，上调p21和Bax 蛋白表达，降低胞活力，诱导细胞凋亡，与前人研究结论相吻合。进一步研究显示抑制miR-139-3p 表达可逆转抑制PCAT6 对骨肉瘤细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。以上结果提示在骨肉瘤中lncRNA PCAT6 通过靶向负性调控miR-139-3p 发挥其致癌作用。

综上所述，lncRNA PCAT6 在骨肉瘤中表达上调，miR-139-3p 表达下调。抑制 lncRNA PCAT6 通过靶向miR-139-3p 可抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，lncRNA PCAT6 是骨肉瘤的潜在治疗靶点。