小黄花茶（Camellia luteoflora Y.K.Li）花和叶中挥发性成分的分析

金瑭，代玉烜，王东，徐海霞，王丽

（四川大学生命科学学院，四川成都 610064）

小黄花茶（Camellia luteofloraY.K.Li），隶属于山茶科山茶属，是我国的特有物种，目前仅在贵州赤水及四川泸州发现其分布[1],[2]。小黄花茶因具有与金花茶同样的花色及其分布的狭域性而受到人们的关注，但相关研究目前主要集中在植物生理、种群生态、繁育等领域[3]。野生小黄花茶虫害较多，常受天牛科、叶甲科、蚜虫科、蚂蚁和潜叶蛾的侵害[4]。植物的挥发油往往对植食性昆虫具有引诱和寄主定位作用。如油菜中的3种硫氰酸酯对蓝荚象甲（Ceutorhynchus assimilis）成虫有强烈的引诱作用[5]。茶树叶中的(Z)-3-己烯-1-醇，(Z)-3-己烯乙酸酯和芳樟醇会吸引茶小绿叶蝉（Empoasca onukii）成虫[6]，这种吸引力会引起或加剧虫害。病虫害被认为是影响小黄花茶正常繁衍生长的主要因素之一，因此，研究小黄花茶的挥发油成分，对其栽培管理过程中病虫害的防治具有十分重要的意义。

另一方面，中国拥有4000多年的茶历史，早在《神农百草经》中就有用茶叶“解毒”的记载。据调查，四川省泸州的山民将小黄花茶的花风干后作为茶饮，其茶品呈淡黄色，并具有特殊的香气。茶的挥发性成分不仅是评价茶品质的重要指标之一[7]，而且还具有抗肿瘤、抗过敏、抗炎和抗氧化等药理活性[8]。植物的挥发性成分较为复杂，其组成还受植物的生长器官、生长环境等因素的影响。前人虽然检测了小黄花茶叶片中茶多酚和咖啡碱的含量[9]，但对于其挥发性成分的研究却未见报道。因而，人们对小黄茶的化学成分、保健价值等还缺乏相应的认识，这种饮用方式存在一定的风险性。

挥发性成分的提取常用水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂萃取法等。不同的提取方法在其组成上有所差异。相较而言，超声辅助提取法（Ultrasonic-Assisted Extraction，UAE）具有时间短、易操作、得率高和成本低等特性，华燕青等人[10]在提取薄荷挥发油时发现UAE的平均得率、薄荷醇和薄荷酮的得率明显高于水蒸气蒸馏法；顶空固相微萃取法（Head Space Solid-Phase Micro-Extractions，HS-SPME）则具有易操作、简便、提取得率高、重复性好和减少对样品预处理的优点，常用于致香成分研究[11]，王强强[12]等人在提取八角茴香中的烯烃类、酮类、芳香烃类化合物时发现，HS-SPME要优于溶剂萃取法。

因此，本文采用HS-SPME和UAE两种方法分别提取小黄花茶的花和叶的挥发油，并利用气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）对其成分进行分析，研究不同提取方法对其挥发性成分组成的影响，以及不同器官间的挥发油成分的差异，以期为小黄花茶栽培管理中的虫害防治和开发利用提供理论依据和相应的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料采集

小黄花茶（Camellia luteofloraY.K.Li）的叶和花于2020年10月采集于四川省泸州市古蔺县。

1.2 实验试剂和仪器

正己烷（AR），无水Na4SO4（AR），液氮，SB25-12DTN超声波清洗机（600 W），BUCHI R-300旋转蒸发仪，GCMS-QP2010 Plus（日本SHIMADZU），萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

液氮中研磨叶子至粉碎，过60目筛。

1.3.2 挥发油提取

HS-SPME：分别称取2 g花和叶，加入20 mL顶空瓶中，水浴锅60 ℃，平衡30 min，萃取45 min，270 ℃下解析2 min，270 ℃老化30 min，将此法提取的花挥发油样品命名为GH，叶挥发油样品命名为GY。

UAE：分别取2 g花和叶子的粉末放入三角烧瓶，按照料液比1:20加入40 mL正己烷，80 ℃水浴超声1 h后取出过滤，重复提取两次，合并滤液，减压浓缩后加入2 mL正己烷充分溶解，600 r/min离心10 min，将此法提取的花挥发油样品命名为CH，叶挥发油样品命名为CY。

1.3.3 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）联用分析

GC-MS条件：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：高纯度氦气；流速；1 mL/min；分流比：5:1；进样量1 μL。EI电力源，能量70 eV；离子源温度200 ℃；接口温度220 ℃；溶剂延迟0.1 min，扫描范围33～500m/z。

升温程序1：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min的速度上升到150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速度继续上升到280 ℃，保持3 min。

升温程序2：50 ℃保持5 min，以10 ℃/min的速度上升到260 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度继续上升到290 ℃，保持15 min。

质谱检索：NIST08.LIB。

1.4 数据处理

利用NIST 98.L谱库对得到的质谱图进行串连检索和人工解析，质谱匹配度＞80%作为物质鉴定标准，使用面积归一法计算相对含量。

2 结果与讨论

2.1 总离子流图

样品GH和GY采用升温程序1，样品CH和CY采用升温程序2，总离子流图如图1所示。

图1 样品GH、GY、CH和CY的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of GH, GY, CH and CY

2.2 四个样品挥发性成分的组成

鉴定出的化学成分和相对含量如表1所示。

表1 样品GH、GY、CH和CY的GC-MS分析结果Table 1 Analysis results of GH, GY, CH and CY by GC-MS

从小黄花茶中共检测到137种化学成分，鉴定出121种。花中共检测到88种，鉴定出74种，其中GH中有46种，CH中有28种。叶中共检测到85种，鉴定出72种，其中GY中有49种，CY中有24种。

2.2.1 HS-SPME法的提取组分

GH样品中检测到50种挥发性成分，鉴定出46种，占该样品挥发性成分含量的98.53%。包含13种萜类化合物（38.36%）、9种芳香族化合物（8.47%）和24种脂肪族化合物化合物（51.70%），各类中含量最高的分别为芳樟醇（33.12%）、甲苯（4.43%）和反式-2-己烯醛（17.51%）。

GY样品中检测到51种挥发性成分，鉴定出49种，占该样品挥发性成分含量的99.47%。包含17种萜类化合物（9.21%）、10种芳香族化合物（4.05%）和22种脂肪族化合物（86.21%），各类中含量最高的分别为芳樟醇（2.14%）、间氯二苯（1.13%）和反式-2-己烯醛（40.73%）。

2.2.2 UAE法的提取组分

CH样品中检测到31种挥发性成分，鉴定出28种，占该样品挥发性成分含量的63.59%。包含2种萜类化合物（2.83%）、1种甾类化合物（10.58%）、2种芳香族化合物（4.26%）和23种脂肪族化合物（45.92%），各类中含量最高的分别为1,6,10,14,18,22-Tetracosahexaen-3-ol，2,6,10,15,19,23-hexamethyl-，(all-E)-（1.68%）、(3BETA,23E)-9,19-环羊毛甾-23-烯-3,25-二醇（10.58%）、Terephthalic acid，di(2-ethylhexyl)ester（4.09%）和三十六烷（9.17%）。

CY样品中检测到36种挥发性成分，鉴定出24种，占该样品挥发性成分含量的72.31%。包含6种萜类化合物（31.49%）、2种甾类化合物（3.76%）、5种芳香族化合物（11.93%）和11种脂肪族化合物（25.13%），各类中含量最高的分别为角鲨烯（17.31%）、为星鱼甾醇（2.03%）、维生素E（9.34%）和α-香树脂醇乙酸酯（9.84%）。

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2.2.3 两种提取方法的挥发性成分的种类差异

HS-SPME提取到23种萜类（23.84%）、13种芳香族化合物（6.27%）和38种脂肪族化合物（69.10%），未鉴定出的成分占0.79%。UAE提取7种萜类（17.50%）、3种甾类（7.31%）、7种芳香族化合物（8.25%）和32种脂肪族化合物（36.22%），未鉴定出的成分占30.72%。相较而言，HS-SPME的鉴定率更高，提取到更多的萜类和芳香族类，没有提取到甾类。

2.2.4 花叶挥发油成分综合分析

综合两种提取方法的结果，花挥发油中含有15种萜类化合物（20.78%），1种甾类化合物（5.34%），11种芳香族化合物（6.42%），46种脂肪族化合物（48.52%）；含量最高的为芳樟醇（16.71%），其次是反式-2-己烯醛（8.83%）、乙醇（5.88%）、(3BETA,23E)-9,19-环羊毛甾-23-烯-3,25-二醇（5.34%）和己醛（4.77%），含量不低于1%的有16种，未鉴定出14种。

叶挥发油中含有23种萜类化合物（20.61%），2种甾类化合物（1.90%），14种芳香族化合物（8.06%），33种脂肪族化合物（56.39%）；含量最高的为反式-2-己烯醛（20.63%），其次为己醛（10.26%）、角鲨烯（8.77%）、α-香树脂醇乙酸酯（4.98%）和维他命E（4.73%），含量不低于1%的有18种，未鉴定出13种（图2）。

图2 小黄花茶花和叶的挥发油各类化合物种类及含量占比Fig.2 Types and contents of volatile oil in Camellia luteoflora Y.K.Li

花和叶中共同检测到的化合物有25种，分别占花挥发性成分含量的44.82%，叶的47.69%，其中含量差异最大的为芳樟醇，相差15.62%，其次为反式-2-己烯醛和己醛，分别相差11.80%和5.49%（图3）。

图3 小黄花茶花和叶共有化合物及含量的百分比堆积图Fig.3 Percentage accumulation diagram of common compounds and their contents in flowers and leaves of Camellia luteoflora Y.K.Li

3 结论

3.1 小黄花茶花和叶挥发性成分的差异

小黄花茶中共鉴定出121种成分，包括25种花和叶共有、49种花特有、以及47种叶特有的化合物。花叶共有成分中，花中含量高于叶的有8种，叶中含量高于花的有17种，花和叶中含量相差大于1%的有10种。其中芳樟醇、反式-2-己烯醛和己醛的含量差异较为明显。花的特有成分中，含量高于1%的化合物有10种。主要有乙醇、(3BETA,23E)-9,19-环羊毛甾-23-烯-3,25-二醇、二十烷、1-溴三十烷和水杨酸乙酯等。叶的特有成分中，含量高于1%的化合物有8种，主要有角鲨烯、木栓酮、维他命E和α-香树脂醇乙酸酯等。

植物次生代谢产物的产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。宋双红[13]等发现黄芩（Scutellaria baicalensis）的花、茎叶、根和种子挥发油的成分和相对含量各不相同。张康健研究杜仲（Eucommia ulmoides）叶次生代谢物生长的积累动态时认为其叶片中的次生代谢产物有些不能被转移和运输[14]。因此，小黄花茶的花和叶在挥发性组分上的差异性，可能与其器官间挥发油含量的积累和贮存的独立性，以及其代谢途径的不完全开放性有关。

3.2 HS-SPME法和UAE法的提取组分差异

两种方法提取的挥发性成分几乎完全不同。从总离子图看，HS-SPME法所的化合物保留时间集中在0.5～21 min内，是一些沸点较低、分子量较小的化合物。UAE法所得化合物GC-MS保留时间集中在12～48 min内，沸点较高、分子量较大。

HS-SPME法是集采样、萃取、浓缩、进样于一体的无溶剂提取技术, 简单易行,在香气研究中得到广泛应用[15]。在小黄花茶中，HS-SPME提取得到的萜类化合物达到总量的38.36%（花），远超UAE的2.83%（花），而且鉴定率高达99.21%，敏感度极高。此外，在芳樟醇的提取上，HS-SPME法（33.12%）显著优于UAE法（2.14%）。

与HS-SPME相比，UAE法所得的挥发油物质较少。胡均鹏等人[16]比较了不同提取方法对安化茯砖茶挥发油成分的影响，认为UAE法中超声波对挥发性物质具有一定的破坏作用，此外所使用溶剂的极性也会影响到其组成。本研究中对芳香族类化合物的提取以UAE法更优，可达总量的11.93%（叶），高于HS-SPME法的4.05%（叶），且能提取到更多的直链和带支链烷烃。此外，UAE还提取到较高含量的角鲨烯（17.31%），对其超声时间、功率和温度等条件进一步优化后有望成为从小黄茶茶中提取角鲨烯的方法。

3.3 小黄花茶挥发油中具有生物活性的成分

小黄花茶中挥发性油中含量较高的有芳樟醇、角鲨烯、甲苯、维他命E、己醛、反式-2-己烯醛和水杨酸甲酯等，这些成分除了可作香料、化工原料外，大都具有一定的生物活性。如芳樟醇作为香料和调味剂应用于日化品和食品加工中，是合成维生素E、A的重要中间体，另外具有镇痛、抗焦虑、镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗氧化等作用[17],[18]，且天然芳樟醇因具有旋光性而在医药价值上高于合成芳樟醇。茶叶中，芳樟醇是含量很高的香气成分之一，与信阳毛尖（10.35%）[7]和龙井茶（13.75%）[19]等相比，小黄花茶中的含量高达33.12%，作为饮品其香气更浓。

此外，反式-2-己烯醛能显著抑制梨果黑斑病菌的孢子萌发和菌丝生长[20]，并可通过熏蒸方式来防治松材线虫[21]；角鲨烯是一种珍贵的天然产物，具有保健、防癌抗癌、抗氧化和防辐射等作用，广泛应用于日化、医药和食品等领域[22]；天然维生素E稳定，不仅是理想的食品抗氧化剂，还具有抗不育和抗衰老功能。因此，小黄花茶挥发油具有较大的开发利用潜力。

3.4 小黄花茶挥发油成分与虫害

据报道，芳樟醇对叶甲科的马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）雄虫具有很强的引诱作用[23]；己醛能够引诱蚜科的茶蚜（Toxoptera aurantii）[24]。郭晓春等研究了油茶挥发物对刺股沟臀肖叶甲的引诱，发现壬醛（2.21%）、芳樟醇（12.96%）和香叶醇（7.52%）具有明显的引诱效果[25]。虫害是造成野生小黄花茶种群数量稀少的主要原因之一，其昆虫主要来源于天牛科、叶甲科、蚜科等[4]。我们推测其虫害原因可能与该植物中所含的上述挥发性成分有关，但尚需后续实验进行验证。因此，在栽培管理上除了喷洒药物和熏蒸防治措施外，还应该通风，降低栽培温度以减少其挥发油的散发，从而减少对害虫的吸引。

总之，小黄花茶含有多种具有生物活性和药用价值的成分，具有很好的开发利用价值。然而这其中也不乏昆虫的“引诱剂”，因此需要进一步研究小黄花茶的自我防御机制，并采取相应的措施，从而提高小黄花茶的栽培管理水平。